ホメオヘムプロテイン

本研究では、活性酸素を生成する既存のヘムタンパク質に塩基配列特異的DNA結合能を持つ転写因子を融合させ、配列特異的に遺伝子を切断する人工ヘムタンパク質を構築した。具体的には、4本のα-ヘリックスからなるヘリックスバンドル型タンパク質であるシトクロムb562を構造的な土台とし、これのアミノ末端にホメオドメインタンパク質であるAntpのDNA認識ドメインを遺伝子工学的に融合させた。両者をつなぐリンカーとしてグリシン5残基を挿入した。この融合蛋白質のDNA結合能を、ゲルシフト法を用いて評価した。Antpの認識配列(5'-CCATTA)を含む18塩基対からなる短鎖DNAを用いて調べたところ、このDNAと融合タンパク質は1:1で結合することがわかった。そこで、さらに長い200塩基対からなるDNA断片を用いてDNaseIによるフットプリントアッセイを行ったところ、この融合蛋白質はAntp認識配列に結合することが確認できた。そこで、このDNAを用いて酸化的遺伝子切断を行い、「切れ味」を評価した。過酸化水素の添加により反応を開始させたところ、数ヶ所でDNAの切断が見られたものの、Antp認識配列の近傍にて最も高い切断頻度を示すバンドが観測された。これらのことから、本研究で作成した融合タンパク質が、特異的塩基配列を認識し、その近傍において、DNAを切断できることが明らかとなった。この知見に基づき、Antpを他のホメオドメインに置換すれば、塩基配列特異性の異なった新規融合タンパク質が構築できると考えられる。

本研究では、活性酸素を生成する既存のヘムタンパク質に塩基配列特異的DNA結合能を持つ転写因子を融合させ、配列特異的に遺伝子を切断する人工ヘムタンパク質を構築した。具体的には、4本のα-ヘリックスからなるヘリックスバンドル型タンパク質であるシトクロムb562を構造的な土台とし、これのアミノ末端にホメオドメインタンパク質であるAntpのDNA認識ドメインを遺伝子工学的に融合させた。両者をつなぐリンカーとしてグリシン5残基を挿入した。この融合蛋白質のDNA結合能を、ゲルシフト法を用いて評価した。Antpの認識配列(5'-CCATTA)を含む18塩基対からなる短鎖DNAを用いて調べたところ、このDNAと融合タンパク質は1:1で結合することがわかった。そこで、さらに長い200塩基対からなるDNA断片を用いてDNaseIによるフットプリントアッセイを行ったところ、この融合蛋白質はAntp認識配列に結合することが確認できた。そこで、このDNAを用いて酸化的遺伝子切断を行い、「切れ味」を評価した。過酸化水素の添加により反応を開始させたところ、数ヶ所でDNAの切断が見られたものの、Antp認識配列の近傍にて最も高い切断頻度を示すバンドが観測された。これらのことから、本研究で作成した融合タンパク質が、特異的塩基配列を認識し、その近傍において、DNAを切断できることが明らかとなった。この知見に基づき、Antpを他のホメオドメインに置換すれば、塩基配列特異性の異なった新規融合タンパク質が構築できると考えられる。