動物個体のリアルタイムイメージングを可能とする生物発光小分子プローブの創製

创建生物发光小分子探针，能够对个体动物进行实时成像

• 批准号: 16651106
• 负责人: 浦野 泰照
• 金额: $ 2.3万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2004
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2004 至 2006
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-16651106/
• 关键词: 生物発光法; 光誘起電子移動; ルシフェリン; 論理的設計; 蛍光エネルギー移動; ルシフェラーゼ; 個体イメージング; TokyoGreen

昨年度までの研究で確立した、生物発光特性の電子移動による制御(Bioluminescent enzyme-induced electron transfer;以下BioLeTと略す)に基づくプローブ設計に必須となる、発光On/Offの境界電子密度を正確に決定するため、様々な電子密度を有する芳香環を持つパイロット化合物を合成し、その発光特性を精査した。その結果、アミノルシフェリン発光中間体に対する電子移動はアニソール程度の芳香族化合物でも起こりうる一方、発光中間体を電子供与体とするd-BioLeTはニトロベンゼン程度の電子受容能では起こりえないことが明らかとなり、a-BioLeTによるプローブ化に適した骨格であることが明らかとなった。次にアミノルシフェリンと通常のルシフェリンの発光波長が40-50nm程度異なることを利用し、ウェスタンブロットの2次抗体用の酵素として汎用される、HRPとALPの同時定量を試みた。具体的にはHRP/過酸化水素系の発光プローブとして昨年度までに開発に成功したAPLを、ALPのプローブとしては市販のリン酸化ルシフェリンを用い、両者の混在する発光からスペクトル分析で2種の発光を分離することを試みた。具体的には両酵素を任意の割合で混合し、ここに2種のプローブを添加した後、ルシフェリン、ATPを加え、2種の発光スペクトルの分離定量を試みた。その結果、545nmと615nmのフィルターを用いて得られる発光強度を、基準スペクトルパターンに基づいて解析することで両者の分離が可能であり、実際HRP, ALPの活性を同時に検出・定量出来ることが示された。本結果は、ウェスタンブロット膜上における2種以上のタンパクの定量を、同時に信頼性高く行うことを可能にするものであり、分析手法としての生物発光法の幅を広げる画期的なものである。

The まで まで study of the previous year で established <s:1> た and Bioluminescent enzyme-induced electron transfer. The following BioLeT と slightly す) に づ く プ ロ ー ブ design に must と な る 発 light On/Off の state electron density を に right decision す る た め, others 々 な electron density を have す る aromatic ring を hold つ パ イ ロ ッ を ト compounds synthesis し, そ の 発 light feature を fine check し た. そ の results, ア ミ ノ ル シ フ ェ リ ン 発 light intermediates に す seaborne る electronic mobile は ア ニ ソ ー ル degree の aromatic compounds で も up こ り う る side, 発 intermediates を electronic light body and supply と す る d - BioLeT は ニ ト ロ ベ ン ゼ ン degree の electronic by capacity can で は up こ り え な い こ と が Ming ら か と な り, a - BioLeT に よ る プ Youdaoplaceholder0 ブ ブ transformation に appropriate た bone structure である とが とが bright ら となった となった. Time に ア ミ ノ ル シ フ ェ リ ン と usually の ル シ フ ェ リ ン の 発 が 40 to 50 nm wavelength light degree different な る こ と を using し, ウ ェ ス タ ン ブ ロ ッ ト の two antibodies with の enzyme と し て domestic さ れ る, HRP と ALP の and quantitative を み た. Specific に は HRP/acidification passes water element is の 発 light プ ロ ー ブ と し て yesterday annual ま で に open 発 に successful し た APL を, ALP の プ ロ ー ブ と し て は city vendor の リ ン acidification ル シ フ ェ リ ン を い, struck の mix in す る 発 light か ら ス ペ ク ト ル analysis two の で 発 す を separated る こ と を try み た. Specific に は struck enzyme を arbitrary の cut で mixed し, こ こ に two の プ ロ ー ブ を add し た, ル シ フ ェ リ ン, ATP を え, two の 発 light ス ペ ク ト ル の separation quantitative を try み た. そ の results, 545 nm 615 nm と の フ ィ ル タ ー を with い て have ら れ る 発 light intensity を, benchmark ス ペ ク ト ル パ タ ー ン に base づ い て parsing す る こ と で struck is の separation が may で あ り, be interstate HRP, ALP の を active at the same time に 検 out, quantitative out る こ と が shown さ れ た. This results は, ウ ェ ス タ ン ブ ロ ッ ト membrane に お け る above 2 kinds of の タ ン パ ク の quantitative を, meanwhile に 頼 sex line high く う こ と を may に す る も の で あ り, analysis technique と し て の biological 発 method の picture を hiroo げ る painting period な も の で あ る.

项目成果

Evolution of fluorescein as a platform for finely tunable fluorescence probes

• DOI: 10.1021/ja043919h
• 发表时间: 2005-04-06
• 期刊: JOURNAL OF THE AMERICAN CHEMICAL SOCIETY
• 影响因子: 15
• 作者: Urano, Y;Kamiya, M;Nagano, T
• 通讯作者: Nagano, T

酸化ストレスマーカー

氧化应激标记物

• 发表时间: 2005
• 作者: 宮澤陽夫;都築毅;仲川清隆;Yosuke Amagai;宮澤陽夫;He W.;宮澤陽夫;Keitaro Ohmori;宮澤陽夫
• 通讯作者: 宮澤陽夫

The detection and quantification of highly reactive oxygen species using the novel HPF fluorescence probe in a rat model of focal cerebral ischemia

• DOI: 10.1016/j.neures.2005.08.002
• 发表时间: 2005-11-01
• 期刊: NEUROSCIENCE RESEARCH
• 影响因子: 2.9
• 作者: Tomizawa, S;Imai, H;Saito, N
• 通讯作者: Saito, N

Highly Sensitive Near-infrared Fluorescence Probes for Nitric Oxide and Their Application to Isolated Organs.

高灵敏一氧化氮近红外荧光探针及其在离体器官中的应用。

• 发表时间: 2005
• 期刊: J.Am.Chem.Soc. 127
• 作者: E.Sasaki;H.Kojima;H.Nishimatsu;Y.Urano;K.Kikuchi;Y.Hirata T.Nagano
• 通讯作者: Y.Hirata T.Nagano

別冊医学のあゆみ レドックス-ストレス防御の医学-

Sessatsu 医学史 Redox - 压力防御医学 -

• 发表时间: 2005
• 作者: Uzawa;H;Nishida;Y. 他4名;T.Morii;T.Morii;T.Morii;Tasuku Ueno;Takatoshi Yogo;Yasuteru Urano;Shinichiro Tomizawa;Yasuteru Urano;Eita Sasaki;Hisae Kadowaki;Tasuku Ueno;浦野 泰照;浦野泰照
• 通讯作者: 浦野泰照