希少標本を用いた病原菌と宿主の時空間的遺伝子動態解析

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希少乾燥標本からの核酸試料の調製方法を確立することが本研究の今後の展開に大きな影響を与えると考えられたので、により、ススキさび病菌(Puccinia miscanthi)およびメダケ赤衣病菌(Stereostratum corticioides)の各種標本を用いて、核酸抽出手法について検討した。具体的には、乾燥標本を用いて、顕微鏡下で他の微生物等の混入を極力排除する条件下において、効率よく核酸試料を抽出精製出来る条件についてしらべた。その結果、シリコンコートした標準カバーグラスとスライドグラスを用いて、核酸抽出緩衝液中で目的のサンプルを含む植物組織を分解し、対象となる夏胞子あるいは冬胞子をマイクロピペットで吸い上げて、別のカバーグラス上に分離し、その上にシリコンコートしたカバーグラスをかけて、ピンセットにてスライドグラスとの間に挟み込み、押しつぶす方法が最も収量も良く、再現性も高いことが判明した。抽出緩衝液はSDSを含まないタイプのものでは、そのままPCRによるDNA増幅が可能である例が多かった。SDSとプロテイナーゼKを含む緩衝液を用いた場合はフェノール抽出が必要であったので、200μチューブを用いて、20μl以下の微少量によるフェノール抽出を行った。いずれの場合においても、抽出核酸試料は極微量であったため、定量は出来なかった。しかし、リボソームDNAをターゲットとして用いたPCR反応による解析では増幅が可能であった。一方、それぞれの試料に多コピー含まれることが明かとなっている二本鎖RNA試料に関してはターゲット配列の情報が無く、既知の二本鎖RNAウイルスの複製酵素の保存配列情報に基づいて設計したプライマーを用いて逆転写反応を試みたが、期待された増幅産物は得ることが出来なかった。これに関しては、当該RNAを精製して塩基配列を決定する必要があるものと考えられた。