遺伝子銃を用いた病原体感染シグナル伝達機構に関する研究

これまでの研究で、ホタルルシフェラーゼ遺伝子(LUC)をレポーターとして用い、形質転換植物あるいは培養細胞を用いた、タバコ病原関連遺伝子PRlaの発現誘導を検出する系を確立している。しかし、これらの形質転換体を用いた系では多種類のプラスミドDNAを同時に導入する必要がある実験を行うことが極めて困難で、転写活性化実験等には適していない。そこで、遺伝子銃によりプラスミドDNAを直接導入し、高感度な遺伝子発現検出系であるウミシイタケルシフェラーゼ(Renilla luciferase)を用いたDual Luciferase Assayによる一過性遺伝子発現解析の実験系について検討した。この実験系ハプロトプラストの調製や、大量のプラスミドDNA精製が不要で、極めて簡便に遺伝子発現実験を実施できる等の利点がある。本研究ではタバコBY-2細胞を用いて、サリチル酸処理や、PR1活性化因子を発現するプラスミドDNAの導入などによるPRlaの発現の変化を解析した。その結果、シロイヌナズナ由来の誘導抵抗性強化遺伝子のゲノムDNA断片を導入し、CaMV35Sプロモーターで発現させることにより、PRlaプロモーター制御下のLUC遺伝子の活性化が認められた。この結果から、一過性実験によっても、当初望まれていたような発現誘導実験が可能であることが示され、今後の研究を展開する上で、非常に有意義な知見を得ることが出来た。さらに、大気圧中で遺伝子導入実験が可能なハンドヘルド型遺伝子銃を用いた高等植物用遺伝子導入系の最適化を試み、良好な実験条件を設定することが出来た。

これまでの研究で、ホタルルシフェラーゼ遺伝子(LUC)をレポーターとして用い、形質転換植物あるいは培養細胞を用いた、タバコ病原関連遺伝子PRlaの発現誘導を検出する系を確立している。しかし、これらの形質転換体を用いた系では多種類のプラスミドDNAを同時に導入する必要がある実験を行うことが極めて困難で、転写活性化実験等には適していない。そこで、遺伝子銃によりプラスミドDNAを直接導入し、高感度な遺伝子発現検出系であるウミシイタケルシフェラーゼ(Renilla luciferase)を用いたDual Luciferase Assayによる一過性遺伝子発現解析の実験系について検討した。この実験系ハプロトプラストの調製や、大量のプラスミドDNA精製が不要で、極めて簡便に遺伝子発現実験を実施できる等の利点がある。本研究ではタバコBY-2細胞を用いて、サリチル酸処理や、PR1活性化因子を発現するプラスミドDNAの導入などによるPRlaの発現の変化を解析した。その結果、シロイヌナズナ由来の誘導抵抗性強化遺伝子のゲノムDNA断片を導入し、CaMV35Sプロモーターで発現させることにより、PRlaプロモーター制御下のLUC遺伝子の活性化が認められた。この結果から、一過性実験によっても、当初望まれていたような発現誘導実験が可能であることが示され、今後の研究を展開する上で、非常に有意義な知見を得ることが出来た。さらに、大気圧中で遺伝子導入実験が可能なハンドヘルド型遺伝子銃を用いた高等植物用遺伝子導入系の最適化を試み、良好な実験条件を設定することが出来た。