メタサイクロジェネシスにおけるTAMの役割に関する基礎的研究

TAM在后旋流发生中作用的基础研究

• 批准号: 16658113
• 负责人: 井上 昇
• 金额: $ 2.3万
• 依托单位: Obihiro University of Agriculture and Veterinary Medicine
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2004
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2004 至 2005
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-16658113/
• 关键词: アフリカトリパノソーマ; 試験管内培養; ライフサイクル; ツェツェバエ; エピマスティゴート; 細胞分化; 表面抗原; 細胞接着; メタサイクロジェネシス; 接着分子

Trypanosoma congolenseエピマスティゴート型虫体(EMF)はツェツェバエの口器内腔に接着し、哺乳動物感染能を有するメタサイクリック型虫体(MCF)へと分化する。EMFの接着はMCFへの分化に必須であることが報告されている。本研究で我々はEMF培養上清中に虫体由来接着分子(TAM : Trypanosome derived cell Adhesion Molecule)が存在することを発見した。そこで、硫安塩析法によってEMF培養上清中のTAMを濃縮し、抗血清を作製した。得られた抗血清を用いて培養上清中からTAMを免疫沈降した結果、分子量100kDaの蛋白質が検出された。TAMの接着活性は熱、過ヨウ素酸ナトリウムまたはプロテアーゼKで処理すると不活化した。よってTAMは糖蛋白質であり、接着活性に糖鎖が関与することが示唆された。硫安塩析法と陰イオン交換クロマトグラフィーで粗精製したTAMに対するレクチンドットブロットの結果、TAMはシアル酸を含む複合型アスパラギン結合糖鎖で修飾されていることが示唆された。EMFのcDNAライブラリーを抗TAM血清でイムノスクリーニングした結果、2,067bpのORFを含む新規遺伝子がクローニングされた。予想アミノ酸配列から、TAMの分子量は72.9kDa、α-ヘリックス構造に富み、非常に親水性が高く、N末端にはシグナル配列、C末端にはGPIアンカー付加あるいは膜貫通領域と思われる疎水性アミノ酸領域が存在することが予測された。ノザンブロットの結果、TAM遺伝子はEMF虫体特異的に発現し、抗TAM抗体による免疫染色でもTAMはEMF虫体表面にのみ発現していた。トリチウム標識エタノールアミンを用いEMF虫体を代謝標識し、標識虫体ライセートからTAMを免疫沈降した結果、TAMがGPIアンカータンパクであることが明らかとなった。以上の結果からTAMはEMFの接着に関与する新規のEMF虫体特異的細胞表面GPI結合型糖蛋白質であることが明らかとなった。得られた成果については現在論文を執筆中である。

Trypanosoma congolense (EMF) can be used to differentiate between different types of insect (MCF). EMF is the next step in MCF differentiation. In this study, we found that TAM (Trypanosome derived cell Adhesion Molecule) existed in EMF culture supernatant. TAM in EMF culture supernatant was concentrated and antiserum was prepared. The antiserum was used in the culture supernatant to detect TAM immunoprecipitation and protein with molecular weight of 100kDa. TAM's adhesive activity is not activated due to heat and heat transfer. The expression of TAM is related to glycan protein and subsequent activity. The results of sulfur analysis and the crude purification of TAM showed that TAM contained a complex type of sulfur in combination with a sugar chain modification. EMF cDNA fragments were detected by anti-TAM serum, and the ORF of 2,067 bp was detected by anti-TAM serum. The molecular weight of TAM is 72.9 kDa, α-terminal structure is rich, very hydrophilic, N-terminal structure is high, C-terminal structure is high, membrane penetration domain is high, and water soluble acid domain is high. The results showed that TAM protein was detected on the surface of EMF insect by immunostaining with anti-TAM antibody. EMF insect metabolism identification TAM immune sedimentation results TAM GPI identification identification identification These results indicate that TAM EMF is associated with the development of new cell-surface GPI-binding glycoproteins. Get the results and write the paper.