Joinasome:DNA二重鎖切断修復に関わる超高次複合体の解明

"Joinasome"とは、真核細胞の主要なDNA二重鎖切断(DSB)修復機構の一つ、非相同末端再結合(NHEJ)反応経路を触媒する酵素群の総体の意である。NHEJにおいては、DSBを認識するDNA-PK、最終的にDNA鎖同士を結合するXRCC4-DNA ligase IVが重要な役割を担うと考えられているが、本研究代表者は、最近数年、DNA-PKによるXRCC4-DNA ligase IV機能調節機構の研究を行っている。その過程で、昨年度、放射線照射後にXRCC4分子がクロマチンDNAに結合し、界面活性化剤抽出に抵抗性となることを見出した。本研究はこのDNA結合状態のXRCC4を含む複合体を単離し、解析することにより、DSB修復機構の全体像解明の一助とすることを目的として行った。複合体単離は、マウスM10細胞(内在性のXRCC4を欠損)にFLAGタグ付きのXRCC4を導入した安定発現株M10-X4を出発材料とし、(1)これに放射線を照射し、一定時間後に回収、(2)界面活性剤を含むバッファで抽出後、遠心、(3)沈澱をヌクレアーゼで部分消化、(4)FLAG抗体カラムによるアフィニティークロマトグラフィー、により行った。まず、小スケール(細胞10^7個程度)の実験により、DNA-PKの必要性、阻害剤の効果、リン酸化部位欠損XRCC4の挙動などを検討した。また、条件至適化の上、スケールアップし(細胞数10^9〜10^<10>個)、成分同定を進めている。なお、この研究遂行にあたり、インド、Bhabha Atomic Research CenterのSushma M.Bhosle氏の協力を頂いた。

"Joinasome"とは、真核細胞の主要なDNA二重鎖切断(DSB)修復機構の一つ、非相同末端再結合(NHEJ)反応経路を触媒する酵素群の総体の意である。NHEJにおいては、DSBを認識するDNA-PK、最終的にDNA鎖同士を結合するXRCC4-DNA ligase IVが重要な役割を担うと考えられているが、本研究代表者は、最近数年、DNA-PKによるXRCC4-DNA ligase IV機能調節機構の研究を行っている。その過程で、昨年度、放射線照射後にXRCC4分子がクロマチンDNAに結合し、界面活性化剤抽出に抵抗性となることを見出した。本研究はこのDNA結合状態のXRCC4を含む複合体を単離し、解析することにより、DSB修復機構の全体像解明の一助とすることを目的として行った。複合体単離は、マウスM10細胞(内在性のXRCC4を欠損)にFLAGタグ付きのXRCC4を導入した安定発現株M10-X4を出発材料とし、(1)これに放射線を照射し、一定時間後に回収、(2)界面活性剤を含むバッファで抽出後、遠心、(3)沈澱をヌクレアーゼで部分消化、(4)FLAG抗体カラムによるアフィニティークロマトグラフィー、により行った。まず、小スケール(細胞10^7個程度)の実験により、DNA-PKの必要性、阻害剤の効果、リン酸化部位欠損XRCC4の挙動などを検討した。また、条件至適化の上、スケールアップし(細胞数10^9〜10^<10>個)、成分同定を進めている。なお、この研究遂行にあたり、インド、Bhabha Atomic Research CenterのSushma M.Bhosle氏の協力を頂いた。