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DNA依存性プロテインキナーゼの放射線応答における役割

DNA 依赖性蛋白激酶在辐射反应中的作用

基本信息

批准号：
13218041
负责人：
松本義久
金额：
$ 2.94万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (C)
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

DNA依存性プロテインキナーゼ(DNA-PK)は放射線応答において重要な役割を担うと考えられているが、「真の基質」が明らかになっていない。本研究では、DNAリガーゼIVと複合体を形成してDNA二重鎖切断修復に関わると予想されているXRCC4タンパク質に着目して検討を行った。まず、ヒト培養細胞を用いた実験から、照射後の細胞内でXRCC4のリン酸化が誘導されること、また、リン酸化の誘導にDNA-PKが関わっていることを示した。次に、組換えXRCC4タンパク質と精製DNA-PKを用いて、DNA-PKがXRCC4を直接にリン酸化できることを示した。更に、種々の解析(ホスホアミノ酸分析、caspaseを用いたペプチドマッピング、抗体エピトープマッピング、アラニン置換体作製等)により、3ケ所のリン酸化部位を同定し、リン酸化状態特異的抗体を作製した。ELISA法により特異性の確認を行ったところ、これらの抗体は目的のリン酸化ペプチドには反応したが、非リン酸化ペプチドや別のリン酸化ペプチドにはほとんど反応しなかった。組換えXRCC4にDNA-PKを作用させた後、これらの抗体を用いてウエスタンブロッティングを行うと、各部位でのリン酸化が見られた。また、それぞれのリン酸化部位のセリンをアラニンに置換した変異体には反応しなかった。これらの結果から、これらの部位が少なくともin vitroではDNA-PKによってリン酸化されること、また、作製した抗体がそれぞれ目的部位のリン酸化状態に特異的に反応していることが確かめられた。今後、これらの抗体を利用し、細胞内でのリン酸化状態について解析を行う予定である。また、以上の検討を行う中で、XRCC4が放射線誘発細胞死の過程で、caspase-3,7様のプロテアーゼによって切断を受けることも見出し、切断部位も明らかにした。

DNA-dependent protein kinase (DNA-PK) is an important part of the radiation response, and the "real matrix" is an important part of the response. In this study, we investigated the formation and repair of DNA double-lock complex. The expression of XRCC4 in cultured cells after irradiation was studied. Next, the composition of XRCC4 is changed from quality to refined DNA-PK, and DNA-PK is changed from XRCC4 to direct acidification In addition, species analysis (acid analysis, caspase use, antibody selection, substitution, etc.), identification of the acidified sites of the three proteins, and production of antibodies specific to the acidified state. ELISA method to confirm the specificity of the antibody to the target of the enzyme, non-enzyme-specific enzyme After the DNA-PK function of XRCC4 was completed, the antibody was used to detect the protein expression in all parts of the body. The acid content of the mixture was reduced to zero. The results are as follows: DNA-PK is the most acidic part of the body, and the antibody is the most acidic part of the body. In the future, the use of antibodies, intracellular acidification, and analysis will be determined. XRCC4 is the process of radiation-induced cell death, caspase-3, and caspase-7 is the process of cell death.