抗体磁気ビーズを用いた内在性微量タンパク質複合体プロテオミクス法の開発

使用抗体磁珠开发内源蛋白复合物蛋白质组学方法

• 批准号: 17651118
• 负责人: 浜窪 隆雄
• 金额: $ 2.11万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2005
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2005 至 2006
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-17651118/
• 关键词: ターゲテドプロテオミクス; 転写複合体; 核内受容体; モノクローナル抗体; 磁性ビーズ; プロテオミクス; HNF4α

細胞内の生理的条件下でのタンパク質相互作用を解析するため、高親和性抗体と低ノイズのビーズを用いた細胞内微量タンパク質複合体の免疫分離法を開発した。細胞内でのシグナル伝達や転写調節には複数のタンパク質が相互作用し、複雑で繊細な調節を可能としている。これらのメカニズムに関与するタンパク質は微量で通常の電気泳動やカラムクロマトを用いるプロテオームの技法では効率よく検出できない。また、強制発現法や2ハイブリッド法を用いる相互作用解析では、候補タンパク質を検出することはできるが、生理的な状態を反映しているといえない。本研究では、独自に開発したバキュロウイルス発現系を用いる免疫法や高感度検出系を組み合わせるスクリーニング法などにより、ターゲットタンパク質に対する高親和性の抗体を作成し、さらに非特異的結合を低減する表面処理をほどこした磁気ビーズに抗体を固定化してターゲットタンパク質を効率よく集めることにより、核内受容体HNF4αなどの転写因子を105個程度の細胞より検出することに成功した。この免疫分離法とショットガンLCMS/MS法を組み合わせることにより、転写調節因子について10^6個程度の細胞より数種類の複合体タンパク質を同定し、MS/MS/MS解析により複合体を形成する内在性のタンパク質についてリン酸化修飾を同定することができた。また、細胞膜上に複合体を形成するタンパク質についてもMS解析が可能であることがわかった。従来、相互作用するタンパク質の同定には大量のサンプルが必要であったが、本研究で開発された方法により、少量で相互作用するタンパク質のダイナミズムを解析することが可能になると考えられる。

为了分析细胞内生理条件下的蛋白质相互作用，我们开发了一种使用高亲和力抗体和低噪声珠的细胞内痕量蛋白质复合物的免疫膜片化方法。多种蛋白质与细胞内的信号传导和转录调节相互作用，从而可以进行复杂而细腻的调节。这些机制所涉及的蛋白质少量，无法使用常规电泳或蛋白质组技术使用柱色谱法进行有效检测。此外，尽管在使用强制表达或两种杂交方法的相互作用分析中可以检测到候选蛋白，但不能说这反映了生理状态。在这项研究中，我们通过使用Baculovirus表达系统和筛选方法结合了高度敏感的检测系统，并通过对抗磁性的抗体结合了磁性粘结型的抗体，从而通过免疫方法和筛选方法结合了对靶标的抗体的磁性粘结，从而，我们通过对目标蛋白产生高亲和力对靶蛋白的高亲和力来成功检测到转录因子，例如核受体HNF4α。 蛋白质。通过将这种免疫凝聚法与shot弹枪LCMS/MS方法相结合，从约10^6个细胞中鉴定出几种类型的复合蛋白进行转录调节剂，并通过MS/MS/MS/MS分析鉴定了用于形成复合物的内源性蛋白的磷酸化修饰。还发现，对于在细胞膜上形成复合物的蛋白质是可能的。通常，需要大量样品来识别相互作用的蛋白质，但据信本研究中开发的方法将允许分析少量相互作用蛋白的动态。

项目成果

ターゲテドプロテオミクス-高親和性抗体を用いた蛋白質複合体解析法

靶向蛋白质组学 - 使用高亲和力抗体的蛋白质复合物分析方法

• 发表时间: 2006
• 期刊: 医学のあゆみ Vol, 219 No, 9
• 作者: 浜窪 隆雄;児玉龍彦;浜窪 隆雄
• 通讯作者: 浜窪 隆雄

モノクロナール抗体を用いた統計的医療への道

使用单克隆抗体的统计医学之路

• 发表时间: 2006
• 期刊: 臨床化学 Vol, 35 No, 2
• 作者: 浜窪 隆雄;児玉龍彦
• 通讯作者: 児玉龍彦