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抗体磁気ビーズを用いた内在性微量タンパク質複合体プロテオミクス法の開発

使用抗体磁珠开发内源蛋白复合物蛋白质组学方法

基本信息

批准号：
17651118
负责人：
浜窪隆雄
金额：
$ 2.11万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至 2006
项目状态：
已结题

项目摘要

細胞内の生理的条件下でのタンパク質相互作用を解析するため、高親和性抗体と低ノイズのビーズを用いた細胞内微量タンパク質複合体の免疫分離法を開発した。細胞内でのシグナル伝達や転写調節には複数のタンパク質が相互作用し、複雑で繊細な調節を可能としている。これらのメカニズムに関与するタンパク質は微量で通常の電気泳動やカラムクロマトを用いるプロテオームの技法では効率よく検出できない。また、強制発現法や2ハイブリッド法を用いる相互作用解析では、候補タンパク質を検出することはできるが、生理的な状態を反映しているといえない。本研究では、独自に開発したバキュロウイルス発現系を用いる免疫法や高感度検出系を組み合わせるスクリーニング法などにより、ターゲットタンパク質に対する高親和性の抗体を作成し、さらに非特異的結合を低減する表面処理をほどこした磁気ビーズに抗体を固定化してターゲットタンパク質を効率よく集めることにより、核内受容体HNF4αなどの転写因子を105個程度の細胞より検出することに成功した。この免疫分離法とショットガンLCMS/MS法を組み合わせることにより、転写調節因子について10^6個程度の細胞より数種類の複合体タンパク質を同定し、MS/MS/MS解析により複合体を形成する内在性のタンパク質についてリン酸化修飾を同定することができた。また、細胞膜上に複合体を形成するタンパク質についてもMS解析が可能であることがわかった。従来、相互作用するタンパク質の同定には大量のサンプルが必要であったが、本研究で開発された方法により、少量で相互作用するタンパク質のダイナミズムを解析することが可能になると考えられる。

Analyzing intracellular interactions and high-affinity antibodies under physiological conditions in cells The low-density lipoprotein was developed using the immunoisolation method of micro-intracellular polypeptide complex. Intracellular でのシグナル伝大や転WRITING REGULATING には plural のタンパクquid quality がinteraction し, complex 雑で繊精品なregulation をpossible としている.これらのメカニズムkan and するタンパクquality は Trace amount でNormal electrophoresis やカThe ラムクロマトを uses the いるプロテオームの technique and the efficiency is the same as the できない.また、Forced appearance method や2ハイブリッド法をUse いるInteraction analysis では、Alternate タンパク性を検出することはできるが、physiological state を Reflection しているといえない. In this study, we independently developed a high-sensitivity immune system and used a high-sensitivity test system to create a new system.リーニング法などにより、ターゲットタンパク性に対するHigh-affinity antibodies are madeし、さらにnon-specific bindingをLow reduction surface treatment をほどこしたMagnetic ビーズにantibody をimmobilization してターゲットタンパクquality をefficiency よくSET めることにより、The nuclear receptor HNF4αなどの転writes the factor を105 degree of the cell より検出することにsuccessfulした.このimmunoseparation method とショットガン LCMS/MS method み合わせることにより, 転WRITING REGULATING FACTOR について 10^6 degree のcell よりnumber species の compound The body quality is the same as the determination, and the MS/MS/MS analysis is the formation of the complex.るIntrinsic のタンパク性についてリンacidified modification を同定することができた. It is possible to form a complex on the cell membrane and analyze it through MS. The reason for the interaction is that the quality of the interaction is the same as that of the large amount of the material.法により、a small amount of interaction するタンパク性のダイナミズムをanalytic することがpossible になると考えられる.