人工膜を用いて膜タンパク質を不溶化させずに無細胞合成する方法

一种使用人工膜无细胞合成膜蛋白而不溶解膜蛋白的方法

• 批准号: 17656270
• 负责人: 田村 実
• 金额: $ 1.86万
• 依托单位: Ehime University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2005
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2005 至 2006
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-17656270/
• 关键词: 無細胞蛋白合成; 膜タンパク質; リポソーム; プロテオミクス; 不溶化対策; フォールディング; 補酵素; GTP蛋白質; 補欠分子族

以下の2種のタンパク質について小麦胚芽の無細胞タンパク合成系による翻訳を行い,生成物の確認を行った。[1]Racの無細胞タンパク合成---ヒトRac(G-蛋白質)のcDNAをプラスミドpEU3^<TM>に組み込んだ。これを,転写に必要な部分とともにPCRで増幅し,mRNA調製キットで転写してmRNAを調整し,ゲル濾過で精製した.このmRNAを小麦胚芽系キットに入れ,透析法で翻訳させた。SDS-PAGEおよびWestern blottingにより目的のタンパク質が合成されたことを確認した.収量は反応液1mlあたり84μgであった。合成タンパク質は,他の因子とともにNADPH oxidaseを構成しO_2^-生成活性を示した。ただ,比活性は大腸菌で発現したものと比べると低く,一部フォールディングがきちんとしていないタンパク質を含むと思われた。この点は今後解決すべき問題と思われた。[2]gp91^<phox>の無細胞合成---gp91^<phox>は、白血球膜に存在するフラボシトクロムであり,O_2^-生成酵素の本体である。ここでは、gp91^<phox>分子の後半4分の3部分の発現を試みた。この領域はNADPHとフラビンを結合する領域であるが,比較的疎水性が高い。gp91^<phox>短縮型のmRNAは上述と同様にして行った。タンパク合成は初めての試みとして,系にリポソームを共存させて行なった。なお系には目的タンパク質の補因子FADを添加した。透析法による翻訳後,超遠心すると発現した目的タンパク質のかなりの部分が沈澱した。SDS-PAGEおよびWestern blottingにより目的のタンパク質が合成されたことが確認された.沈澱には他のタンパク質がほとんど含まれなかった。このことから,予想どおり,本タンパク質は発現と同時に系に存在するリポソームに取り込まれたこと,またこのやり方は発現と分離が同時に行えるすぐれた方法であることが示された。得られた酵素タンパク質はジアフォラーゼ活性(色素NBTの還元)を示した。したがって,得られたタンパク質の少なくとも一部はフォールディングがまともであることが明らかになったが,収量は非常に低く,改善する余地が残った。

The following are two kinds of non-cell-free synthetic system of wheat germ wheat germ, and the product confirmation is done. [1] Rac's cell-free biosynthesis---Rac(G-protein)'s cDNA cDNA pEU3^<TM>に集团み込んだ.これを,転WRITEにNecessary partとともにPCRでamplificationし,mRNA modulationキットで転写してmRNAをAdjustment, ゲルfiltration and purification. このmRNAをWheat germ line キットにれ, dialysis method でtranslation 訳させた. SDS-PAGE, Western blotting, purpose, quality, synthesis, confirmation, yield, reaction solution, 1ml, 84μg, であった. Synthetic タンパク性は, other factor とともにNADPH oxidase is composed of しO_2^-generated active をshows した. The specific activity of coliform bacteria is lower than that of coliform bacteriaールディングがきちんとしていないタンパク性を有むと思われた. The point is to solve the problem in the future. [2] Cell-free synthesis of gp91^<phox>---The existence of gp91^<phox>, the existence of leukocyte membrane, and the body of O_2^-generating enzyme.ここでは、gp91^<phox>The last 4 minutes of the molecule and the 3 parts of the molecule are now をtest みた. The NADPH and NADPH combined with the NADPH and NADPH are relatively high in water resistance. gp91^<phox>Shortened mRNA is the same as the above.タンパク合は初めての考みとして, Department of にリポソームを coexistence させて行なった. The なお system には purpose タンパクquality のsupplement factor FAD を adds した. After the dialysis method has been performed, the supertelecentric part of the tube is partially precipitated. SDS-PAGEおよびWestern The purpose of blotting is the quality of the material and the synthesis of the material. Recognize it. Precipitate it.このことから, I think どおり, 本タンパク性は発appears and とsimultaneously, the system に exists, するリポソームにGET り込まれたこと,またこのやり方は発appears and separates at the same time.に行えるすぐれた法であることが Showされた. Obtained the activity of られたenzyme タンパクはジアフォラーゼ(pigment NBT のreduction) をshow した.したがって,得られたタンパク性の小なくとも一一はフォールディングがまとThe yield is very low and there is still room for improvement.

项目成果

好中球による活性酸素生成の分子メカニズム

中性粒细胞产生活性氧的分子机制

• 发表时间: 2005
• 期刊: Inflamation and Regeneration 25・2
• 作者: K. Shimizu;R. Uozumi;A. Satsuma;Minoru Tamura (田村 実);宮野 佳
• 通讯作者: 宮野 佳

Identification of an actin-binding site in p47phox an organizer protein of NADPH oxidase

• DOI: 10.1016/j.febslet.2005.11.080
• 发表时间: 2006-01-09
• 期刊: FEBS LETTERS
• 影响因子: 3.5
• 作者: Tamura, M;Itoh, K;Oku, S
• 通讯作者: Oku, S

A new-type of O_2^- generating tool for oxidative stress studies by remodeling neutrophil

一种新型O_2^-生成工具，通过重塑中性粒细胞进行氧化应激研究

• 发表时间: 2005
• 期刊: J. Biotechnology 120・4
• 作者: K. Shimizu;R. Uozumi;A. Satsuma;Minoru Tamura (田村 実)
• 通讯作者: Minoru Tamura (田村 実)

酸性リン脂質はNADP oxidaseの影の主役

酸性磷脂是 NADP 氧化酶的无名主角

• 发表时间: 2006
• 期刊: 生化学 78・11
• 作者: 河村憲一;是枝武史;上田光敏;丸山俊夫;T.Furusawa et al.;Takato Mitsudome;伊藤直次ら;Tomoo Mizugaki;佐藤剛史ら 共著;Tomoo Mizugaki;Makoto Murata;Ken Motokura;金田清臣;金田 清臣;田村 実
• 通讯作者: 田村 実

スーパーオキサイド発生剤およびその製造方法

超氧化物发生器及其制造方法

• 发表时间: 2006