循環系のオーファン受容体を特異的に細胞内移行させる未知の生理活性ペプチドの探索

寻找特异性内化循环系统中孤儿受体的未知生物活性肽

• 批准号: 17659234
• 负责人: 桑迫 健二
• 金额: $ 1.98万
• 依托单位: University of Miyazaki
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2005
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2005 至 2007
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-17659234/
• 关键词: 新規ペプチド; オーファン受容体; 安定発現系; 細胞内移行; FACS解析; orphan受容体; 生理活性ペプチド; 遺伝子構築; 新規アッセイ法

G蛋白共役型受容体(GPCR)の多くが、特異的なリガンドの結合により速やかに細胞内移行(インターナリゼーション)する。これまで、種々の培養細胞(HEK-293細胞やCHO細胞)に安定発現させたオーファン受容体(リガンドが未定の受容体の総称)の細胞内セカンドメッセンジャー(cAMPやCa^<2+>)を標的に未知の生理活性物質がいくつも同定されてきたが受容体の細胞内移行を標的にして成功した例は皆無である。今回、循環系の臓器(ブタの左心房、左心室、肺、腎臓、副腎)の抽出液を可能な限り大量に獲得し、濃縮した。その一部を酸化に十分注意(ペプチドのCYs-Cys開裂を防止)しながら凍結乾燥して細胞培養用の培地(サンプル中のペプチドの吸着を防ぐため含有BSAの濃度を1%に増加した)に再溶解し、サンプルを調整した。一方、2種の安定発現系(class Bのヒトオーファン受容体2種)のクローンのうち、FACS解析で細胞膜発現の最も低いものを選定し直し、前述のサンプルを個別に添加したが、蛍光顕微鏡とFACS解析でリガンド依存性の細胞内移行を確認することが出来なかった。我々が樹立したアドレノメデュリン(AM)受容体サブタイプの安定発現系(Kuwasako, et. al. J. Biol. Chem. 2000)に、高濃度のAMが存在するブタ副腎の抽出液を添加したところ、いずれの受容体サブタイプも迅速に細胞内移行したことから、方法論やアッセイの手順に問題はなかったと思われる。種々の条件検討を十分に行った結果、class Bの別のオーファン受容体を用いるのが最適と考え、現在、検討し直している。

G protein co-receptor (GPCR) multiple, specific binding, rapid and intracellular migration The stable development of these two kinds of cultured cells (HEK-293 cells and CHO cells) and the intracellular migration of unknown physiologically active substances targeting the receptors (cAMP and Ca^<2+>) were successful in all cases. Extracts from the organs of the circulatory system (left atrium, left ventricle, lungs, kidneys, accessory kidneys) may be obtained in limited quantities and concentrated. Some of them are acidified (to prevent cracking of CYS-Cys), freeze-dried (to prevent adsorption of BSA), redissolved (to increase the concentration of BSA by 1%), and adjusted. One or two stable development systems (two receptor-type of class B) were selected from among the lowest levels of membrane development by FACS analysis, and the above were added individually. Light microscopy and FACS analysis were used to confirm the independent intracellular migration. The stability development system of the receiver (AM) was established by Kuwasako, et. J. Biol. Chem. 2000), the presence of high concentrations of AM in the extract of the accessory kidney, the rapid intracellular migration of the receptor, and the methodological problems of the procedure. The results of the evaluation of the conditions of the species are very good, and the results of the evaluation are the most suitable for the use of other class B receptors. Now, the evaluation is straightforward.