遺伝子機能阻害を基礎としたアミノ酸の情報伝達機構の解析

基于基因功能抑制的氨基酸信息传递机制分析

基本信息

批准号：
18658053
负责人：
加藤久典
金额：
$ 2.18万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至 2007
项目状态：
已结题

项目摘要

昨年度の研究において、転写因子ATF-4およびボスファターゼPP1cのノックダウンがアミノ酸情報伝達を減弱させることを見いだした。本年度はこれらのさらに上流に位置する伝達経路の関与を明確にする目的で、mTOR経路の上流因子として最近見いだされたhvps34と、これを調節することが示唆されているp150に着目した。ノックダウン効率の検討では、HEK293細胞において、hvps34のmRNAレベルは約30%に、タンパク質レベルは約40%に減少した。一方HepG2においても同程度のノックダウン効率を得ることができた。何れの細胞株においても、p150のmRNAは約30%に減少した。アミノ酸によるmTORの下流にあるp70S6キナーゼのリン酸化はhvps34とp150の何れのノックダウンよっても大きく減弱した。これらのことから、各細胞におけるアミノ酸シグナルの認識にvps34が関わっていることを明らかにし、認識機構の全貌解明に本実験系が有効であることが示された。一方、前年のDNAマイクロアレイによる解析で、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ(PEPCK)の遺伝子をアミノ酸欠乏に対する高応答遺伝子として見いだしたが、この遺伝子の上流域に既知のアミノ酸応答配列に類似した配列が存在することがわかった。この領域を含むレポーターベクターを作成し、転写因子ATF-3やATF-4と共発現させたところ、この領域がこれら因子によって強力な制御を受けていることが示された。このことから、PEPCKはこれまで用いてきたIGFBP-1同様にアミノ酸情報伝達を解析する上での有用なツールとして利用できることがわかった。

在去年的一项研究中，我们发现转录因子ATF-4和bossphatase pp1c的敲低减轻了氨基酸信号传导。今年，为了阐明这些进一步的上游传输途径的参与，我们专注于HVPS34，最近被认为是MTOR途径的上游因素，而P150已被建议调节它。在敲低效率的研究中，HVPS34 mRNA水平降低到约30％，HEK293细胞中的蛋白质水平降低至约40％。另一方面，在HEPG2中达到了相同的敲低效率。在任一细胞系中，P150的mRNA降低至约30％。通过HVPS34或P150的敲低，氨基酸下游的p70s6激酶磷酸化显着降低。这些结果表明，VPS34参与了每个细胞中氨基酸信号的识别，这表明该实验系统有效阐明了完全识别机制。另一方面，上一年的DNA微阵列分析表明，磷酸丙酮酸羧酸羧酸酶（PEPCK）的基因是氨基酸缺乏的一个高反应基因，并且发现与该基因上游区域中存在类似于已知的氨基酸反应序列的序列。生成包含该区域的记者向量与转录因子ATF-3和ATF-4共表达，表明该区域受这些因素的强烈调节。这表明PEPCK可以用作分析氨基酸信号传导的有用工具，就像IGFBP-1一样，直到现在，它已经用完了。