血液脳関門透過能をもつES細胞由来細胞株の樹立と脳内ターゲッティング機構

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1.Sandhoff病マウス由来株化ミクログリアの活性化機構及び脳内移行の解析Sandhoff病は、中枢神経障害を伴うリソソーム病の一種であり、β-Hexosaminidase(Hex)を構成するβ鎖遺伝子の変異が原因で、脳内のGM2ガングリオシド(GM2)の過剰蓄積を伴って発症する常染色体劣性遺伝病である。この疾患モデルマウス(SDマウス:Hexb-/-)の細胞治療およびex vivo遣伝子治療用のドナー細胞の開発を目的として、SDマウス脳由来の株化ミクログリアの性状と脳内移行能を解析した。1) 昨年度、SDミクログリアではGM2、GA2および末端GlcNAc含有オリゴ糖が細胞内に過剰蓄積し、Macrophage inflammatory factor-1(MIP-1α)の産生・分泌が充進していることを明らかにした。本年度は、この充進にPhospholipase C(PLC)、Protein kinase C(PKC)およびB(PKB or Akt)を介したシグナリングが関与し、MIP-1α遺伝子の転写およびタンパク質の分泌制御に異常があることを初めて明らかにした。2) マウスHexbと緑色蛍光タンパク質(GFP)遺伝子を含む組換えレンチウイルスを作製してSDミクログリアに遺伝子導入を行い、得られた恒常発現株を野生型マウスの尾静脈内に注入すると、一部が脳内に移行し、脳幹領域の実質内に侵入しており、脳移行性細胞としての機能を保持していることが明らかになった。2.マウス脳血管内皮細胞株由来ミクログリア誘引因子の解析血液脳関門を構成する脳血管内皮細胞と脳内移行能をもつミクログリアとの相互作用を解明する目的で、マウス脳血管内皮細胞株の培養上清中のマウスミクログリア誘引因子について解析した。1) マウス脳血管内皮細胞株(MBEC4)の培養上清中には、単球には作用しないが、ミクログリアの浸潤や遊走能を促進し、トリプシン感受性を示す液性因子が存在することを明らかにした。培養上清を株化ミクログリアに作用させたところ、CDllbの発現とアクチン重合が増大し、ミクログリアの活性化と運動能の充進が誘導された。2) MBEC4由来培養上清をゲルろ過により分離したところ、500kDa以上の高分子領域と5kDa付近の低分子領域にミクログリア誘引活性が検出され、培養上清では高分子タンパク複合体として存在する可能性が示唆された。3) 一方、血液脳関門を構成するアストロサイト由来の培養上清をMBEC4由来培養上清に混合すると、ミクログリア誘引活性は用量依存的に阻害され、アストロサイト由来のミクログリア誘引阻害因子の存在も示唆された。これらの結果から、脳血管内皮細胞がミクログリアの脳内移行性を促進する液性タンパク因子を分泌しており、一方、アストロサイトは血液脳関門を強化し、ミクログリアの侵入を阻害する因子を分泌していると考えられる。現在、尾繊維芽細胞由来核移植ntES細胞からの血管内皮細胞およびミクログリアの分化誘導を試みている。