あらゆる遺伝子を標的にできるsiRNAトランスジェニックマウスの新規作製方法

抑制効果の異なる複数のESクローンからTgマウスを作製し、ES細胞レベルで1ucifbrase assayによって得られた抑制効果が、マウスレベルでの抑制効果を反映していることを確認するために、SODl-siRNA発現ES細胞のうち、抑制効果が低いクローン(#7)、中等度のクローン(#8、27)、高いクローン(#23)を用い、従来と同じ方法(図2)で計4ラインからそれぞれのキメラマウスを作製した。このオスキメラマウスとメスC57/B6とを体外受精も含めて掛け合わせてF1:siRNATgマウスを試みたが、産児のすべてにトランスジーンが確認できなかった。ES細胞の保存期間が2年を過ぎたことに原因がある可能性を考え、再度SOD1-siRNAをマウス 129 系 ES 細胞にelectroporation して有効なクローンを得ている。また、平行してES細胞に未発現のアンギアゲニン遺伝子を標的としたsiRNAを設計し、ES細胞に導入後、アンギアゲニン遺伝子とRenilla luciferase遺伝子を融合した発現ベクターをco-transfection し、luciferase assayを行うことにより、ES細胞レベルの抑制効果を評価し、抑制効果の得られたES細胞が選択できて、そのキメラマウスが作製できた。しかし、このキメラマウスからもいままでのところgermline transmissionが確認できていない。これらの原因としてshRNA毒性による精子形成に障害がある可能性を考えて、現在polII系promotor下にmiRNA backboneのshRNAを設計して、新たなRNAiトランスジェニックマウスの作製を始めた。

抑制効果の異なる複数のESクローンからTgマウスを作製し、ES細胞レベルで1ucifbrase assayによって得られた抑制効果が、マウスレベルでの抑制効果を反映していることを確認するために、SODl-siRNA発現ES細胞のうち、抑制効果が低いクローン(#7)、中等度のクローン(#8、27)、高いクローン(#23)を用い、従来と同じ方法(図2)で計4ラインからそれぞれのキメラマウスを作製した。このオスキメラマウスとメスC57/B6とを体外受精も含めて掛け合わせてF1:siRNATgマウスを試みたが、産児のすべてにトランスジーンが確認できなかった。ES細胞の保存期間が2年を過ぎたことに原因がある可能性を考え、再度SOD1-siRNAをマウス 129 系 ES 細胞にelectroporation して有効なクローンを得ている。また、平行してES細胞に未発現のアンギアゲニン遺伝子を標的としたsiRNAを設計し、ES細胞に導入後、アンギアゲニン遺伝子とRenilla luciferase遺伝子を融合した発現ベクターをco-transfection し、luciferase assayを行うことにより、ES細胞レベルの抑制効果を評価し、抑制効果の得られたES細胞が選択できて、そのキメラマウスが作製できた。しかし、このキメラマウスからもいままでのところgermline transmissionが確認できていない。これらの原因としてshRNA毒性による精子形成に障害がある可能性を考えて、現在polII系promotor下にmiRNA backboneのshRNAを設計して、新たなRNAiトランスジェニックマウスの作製を始めた。