STIMを中心とした細胞内カルシウム調節機構とサイトカインシグナル

我々が最初に発見したSTIMは、小胞体に存在するカルシウム結合能を持つ蛋白である。特筆すべきは、サイトカイン刺激後の小胞体内カルシウムの枯渇を感知する唯一のカルシウムセンサーである。カルシウムの枯渇を感知したSTIMは、細胞膜直下へ移動しpunctaを形成し、細胞膜に存在するカルシウムチャネルを開放させる。我々は、STIMを中心とした細胞内カルシウム調節に関わる分子機構を解明することを目的として、STIMに結合する分子の網羅的解析を試みた。STIM蛋白のC端領域にFLAG配列をつけた融合蛋白を作製するウイルスベクターを作製した。STIM-FLAG融合蛋白を293T細胞に発現させ、抗FLAG抗体結合ビーズにて免疫沈降した。各免疫沈降物を電気泳動し、特異的バンドを回収し、nano flow LC/MSによるペプチド解析・MASCOTによるデータ分析を行った。結果、STIM分子自身を含む、複数のSTIM結合候補分子を同定した。それらの多くは小胞体内蛋白であったが、数個の細胞質蛋白も含まれていた。各候補分子とSTIMの結合は、免疫沈降一ウエスタンにて確認を行った。特にSTIMと強い結合が認められた1つの小胞体蛋白に注目し、その結合様式を解析した。その結合には、STIMの細胞外領域と膜貫通領域が必要であった。本蛋白を含め複数のSTIM結合候補分子をsiRNAによりノックダウンさせるよう取り組んでおり、細胞内カルシウム調節への影響を解析したいと考えている。既に、先程の小胞体蛋白に関しては、ノックダウンに成功している。本研究を通じ、STIMを中心とした細胞内カルシウム調節に関わる候補分子を多く同定できた。

我々が最初に発見したSTIMは、小胞体に存在するカルシウム結合能を持つ蛋白である。特筆すべきは、サイトカイン刺激後の小胞体内カルシウムの枯渇を感知する唯一のカルシウムセンサーである。カルシウムの枯渇を感知したSTIMは、細胞膜直下へ移動しpunctaを形成し、細胞膜に存在するカルシウムチャネルを開放させる。我々は、STIMを中心とした細胞内カルシウム調節に関わる分子機構を解明することを目的として、STIMに結合する分子の網羅的解析を試みた。STIM蛋白のC端領域にFLAG配列をつけた融合蛋白を作製するウイルスベクターを作製した。STIM-FLAG融合蛋白を293T細胞に発現させ、抗FLAG抗体結合ビーズにて免疫沈降した。各免疫沈降物を電気泳動し、特異的バンドを回収し、nano flow LC/MSによるペプチド解析・MASCOTによるデータ分析を行った。結果、STIM分子自身を含む、複数のSTIM結合候補分子を同定した。それらの多くは小胞体内蛋白であったが、数個の細胞質蛋白も含まれていた。各候補分子とSTIMの結合は、免疫沈降一ウエスタンにて確認を行った。特にSTIMと強い結合が認められた1つの小胞体蛋白に注目し、その結合様式を解析した。その結合には、STIMの細胞外領域と膜貫通領域が必要であった。本蛋白を含め複数のSTIM結合候補分子をsiRNAによりノックダウンさせるよう取り組んでおり、細胞内カルシウム調節への影響を解析したいと考えている。既に、先程の小胞体蛋白に関しては、ノックダウンに成功している。本研究を通じ、STIMを中心とした細胞内カルシウム調節に関わる候補分子を多く同定できた。