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記憶能力を制御する食品成分スクリーニングのためのin vitroアッセイ系の開発

开发用于筛选控制记忆能力的食品成分的体外测定系统

基本信息

批准号：
20658035
负责人：
喜田聡
金额：
$ 1.09万
依托单位：
Tokyo University of Agriculture
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2008
资助国家：
日本
起止时间：
2008 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-20658035/
关键词：
CREB CBP 記憶転写調節蛍光エネルギー移動 GFP 脳機能精神疾患

项目摘要

本課題では、記憶形成プロセスを操作できる食品成分をスクリーニングするための実用的なセルフリー・アッセイ系の新規開発を目指して、 Green Fluorescence Protein(GFP)変異体群間で観察される蛍光エネルギー移動(FRET)利用して、転写調節因子CREBとCBP間の相互作用を促進する、あるいは、阻害する食品成分をスクリーニングするin vitroアッセイ系の構築を試みた。(1)培養細胞を用いた無細胞系に適したYFP-CREBとCFP-CBP融合タンパク質の開発CREB、 CREB内のCBPとの相互作用ドメインであるKinase-Inducible Domain (KID)及びCBP内のCREBとの相互作用ドメインであるKIXドメインを用いて、 CREBあるいはこれらのドメインとYFP及びCFPとの融合タンパク質群(YFP-CREB, YFP-KID, CFP-KIX)を作製した。培養細胞内でこれらYFP及びCFP融合タンパク質群を過剰発現させて、フォルスコリンやイオノマイシンの添加により、 CREBのリン酸化を誘導したところ、リン酸化依存的なCREBとCBPの相互作用をFRETを用いて検出できることが明らかとなった。また、この相互作用は初代培養神経細胞においてもリアルタイムに検出できることが示され、様々なタイプの細胞に応用できることが示された。現在、二つの融合タンパク質を恒常的に発現する培養細胞株の確立を行っている。(2)無細胞FRET検出系用のYFP及びCFP融合タンパク質の生産とFRET検出系の確立発現ベクターpCold等を用いて、(1)で作製されたCREB及びCBP融合タンパク質群の発現ベクターを構築し、大腸菌内での発現を試みた。しかし、発現量が十分ではなかったため、現在、 in vitro転写・翻訳系を用いて融合タンパク質群の発現及び精製を試みている。

The subject is to provide guidance for the development of new regulations for the detection of Green Fluorescence Protein(GFP) among heterogeneous groups, and to promote the interaction between CREB and CBP. The structure of the food system is tested in vitro. (1)Cultured cells were prepared from YFP-CREB and CFP-CBP fusion proteins by using cell-free lines. The Kinase-Inducible Domain (KID) and the interaction of CBP with CREB in CREB and YFP-CREB (YFP-KID, CFP-KIX) in CREB fusion proteins were developed by using YFP-CREB and CFP fusion proteins. In cultured cells, YFP and CFP fusion proteins are produced in vitro, and CREB acidification is induced in vitro, and CREB and CBP interaction is induced in vitro. The interaction between these two factors in primary culture of brain cells was investigated. Now, the two kinds of fusion protein are constantly developed and the establishment of cultured cell lines is carried out. (2)Production of YFP and CFP fusion proteins for cell-free FRET assay and development of FRET assay system;(1) Construction of CREB and CBP fusion proteins for development of FRET assay system; and (2) Development of FRET assay system in Escherichia coli. In addition, the amount of production is very high, and now, in vitro, the production and refinement of quality groups are tested.