クツラベ病における欠損酵素のクローニング遺伝子異常の解析と遺伝子治療の試み

库图拉贝病缺陷酶的克隆 遗传异常分析和基因治疗尝试

• 批准号: 02454270
• 负责人: 岡田 伸太郎
• 金额: $ 4.42万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (B)
• 财政年份: 1990
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1990 至 1992
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-02454270/
• 关键词: ガラクトセレブロシダーゼ; クローニング; クラッベ病; ガラクトシルセラミダ-ゼ; モノクロ-ナル抗体

クラッベ病の欠損酵素であるgalactocerebrosiraseのクローニングをめざし、平成3年度に精製酵素を用い常法にてモノクローナル抗体を作成した。得られたLgG1クラスのモノクローナル抗体1-9-1-9にて発現ベクターλgt11のヒト胎盤由来のcDNAライブラリーをスクリーニングしたが有意のpositive cloneを得る事が出来なかった。そこで精製酵素のアミノ酸配列からオリゴヌクレオナドを合成しこれをブローブとしてcDNAライブラリーのスクリーニングを計画した。精製酵素をSDS-PAGEで分離した分子量約10万のバンドをPVDF膜に転与しN端のアミノ酸配列を気相シークエンサーにて求めたところ最高でアミノ酸14残基まで解続できた。このN端アミノ酸配列より予想されるいくつかのオリゴマーを合成し、これをブローブとして上記のλgt11のcDNAライブラリーをスクリーニング中である。またアミノ酸の内部配列を調べるため、PVDF膜に転写後の蛋白を膜上で酵素消化しペプチドマッピングをとり、得られたペプチドのアミノ酸情報を現在解析中である。一方精製酵素の生化学的性質について調べたところ、至適pHはlaurocholate系では4.2、Chplate系では4.6であり比活性は各々1.48×10^5nmol/hr/mg、2.30×10^5nmol/hr/mgであった。Lineweaver-BurkフロットよりTaurocholate系でVmax=1.54×10^5nmol/hr/mg、Km=5-10βMともとまった。また本酵素の天然基質とGM1ganglioside、人工蛍光基質6-he|aι|eιano|am|no-4-methy|umbe|lifery|-β-ga|actopvranos|deの阻害実験により後2者は競合阻害を示すことが判明した。

The enzyme galactocerebrosirase was not enough for the disease, and the enzyme for the third year of the year was made by the routine method. The LgG1 antibody 1-9-1-9 antibody was detected. The cause of the pregnancy was cDNA. The positive clone was intentionally detected. In order to synthesize the compound, the enzyme and the acid were used to synthesize cDNA. The molecular weight of the purified enzyme SDS-PAGE is about 100000. The molecular weight of the PVDF membrane is similar to that of the N-terminal acid ligand. I don't want to know if I have a problem with N-terminal acid configuration. I don't want to know if I want to make a synthesis. I don't want to know if I have a problem. I don't think so. I don't want to know if I have a problem. I don't want to know if you want to make a synthesis. I don't want to know if you don't want to. The PVDF membrane was lined up with the enzyme digestion, the enzyme digestion, the acid, the protein, the enzyme digestion, the acid, the acid. The specific activity of enzyme in one side of semen was 1.48 × 10 ^ 5nmol

项目成果

Inui K: "A case of chronic GM_1 gangliosidosis preseriling as dystonia:clinical and biochemical studies" J Neuro'gy. 237. 491-493 (1990)

Inui K：“一例慢性 GM_1 神经节苷脂沉积症预表现为肌张力障碍：临床和生化研究”J Neurogy。

Inui K: "Detection of the A to G(3243) mutation of mitochondrial DNA in Japanese families with mitochondrial encephalomyopathies." J Inher Metab Dis.15. 311-314 (1992)

Inui K：“在患有线粒体脑肌病的日本家族中检测线粒体 DNA 的 A 到 G(3243) 突变。”

Taniike M,et al.: "Localization of sphingolipid activator proteinー1(SAPー1) in the brain of a normal human and a patient with metachromatic leukodystrophy." Acta Histochem Cytochem. 24(2). 215-222 (1991)

Taniike M 等人：“正常人和异染性脑白质营养不良患者大脑中鞘脂激活蛋白 1 (SAP-1) 的定位”，Acta Histochem Cytochem 24(2)。

Inui K: "Mitochondrial encephalomyopathies with the mutaion of the mitochondrial tRNA Leu(UUR) gene." J Pediatr.120(1). 62-66 (1992)

Inui K：“线粒体 tRNA Leu (UUR) 基因突变引起的线粒体脑肌病。”

Tsukamoto H: "A case of hallervorden-spatz disease:Progressive and intractable dystonia controlled by bilateral thalamotomy." Brain & Development.14. 269-272 (1992)

Tsukamoto H：“一例 Hallervorden-Spatz 病：通过双侧丘脑切除术控制进行性、顽固性肌张力障碍。”