脂質酸化酵素リポキシゲナーゼによる魚類香気の生合成機序

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魚類のリポキシゲナーゼ（LOX）遺伝子の遺伝子情報を得るために、cDNAクローニングに取り組んだ。また、魚類遺伝子発現解析の基盤を構築するために、内部標準遺伝子に用いる伸長因子（EF-1α）のcDNAクローニングを試みた。海産魚類の鰓からRNAを抽出し、逆転写反応を経て一本鎖cDNAを合成した。LOX用の縮重プライマーは、哺乳類LOXの一次構造と一部の魚類ゲノム情報を基に、種を超えて保存されているアミノ酸配列を得て設計した。EF-1α用の縮重プライマーは、哺乳類から酵母まで保存されている一次構造から設計した。RT-PCR法により、ウマヅラハギとマサバの鰓から、哺乳類の12S-LOXに相同性を持つcDNA断片とEF-1αのcDNA断片を得ることに成功した。PROSITEを用いたモチーフ検索を行ったところ、魚類LOXの断片配列は、アミノ酸配列の全体にわたってLIPOXYGENASE_3（リポキシゲナーゼ鉄結合型触媒ドメイン）が認められ、LOXの酵素活性に必須な非ヘム鉄の結合に重要である3つのヒスチジン残基が保存されていることが分かった。次に転写開始点を含む完全長cDNA配列を得るために、cDNA断片配列から遺伝子特異的プライマーを設計し、5’-および3’-RACEによる完全長cDNAクローニングを試みた。転写開始点の決定には、oligo-capping法を採用した。全RNAのCIPとTAP処理とそれに続くT4 RNA ligaseによる合成オリゴの導入後、逆転写反応に供することで5’-キャップ構造を持つ完全長mRNAのみからRACE-ready cDNAを構築した。