脂質酸化酵素リポキシゲナーゼによる魚類香気の生合成機序

脂质氧化酶脂氧合酶生物合成鱼香味的机制

• 批准号: 22K05828
• 负责人: 河邉 真也
• 金额: $ 2.75万
• 依托单位: Fisheries Research and Education Agency
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2026-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K05828/
• 关键词: リポキシゲナーゼ; cDNAクローニング; LOX; 魚臭; 短鎖オキシリピン

魚類のリポキシゲナーゼ（LOX）遺伝子の遺伝子情報を得るために、cDNAクローニングに取り組んだ。また、魚類遺伝子発現解析の基盤を構築するために、内部標準遺伝子に用いる伸長因子（EF-1α）のcDNAクローニングを試みた。海産魚類の鰓からRNAを抽出し、逆転写反応を経て一本鎖cDNAを合成した。LOX用の縮重プライマーは、哺乳類LOXの一次構造と一部の魚類ゲノム情報を基に、種を超えて保存されているアミノ酸配列を得て設計した。EF-1α用の縮重プライマーは、哺乳類から酵母まで保存されている一次構造から設計した。RT-PCR法により、ウマヅラハギとマサバの鰓から、哺乳類の12S-LOXに相同性を持つcDNA断片とEF-1αのcDNA断片を得ることに成功した。PROSITEを用いたモチーフ検索を行ったところ、魚類LOXの断片配列は、アミノ酸配列の全体にわたってLIPOXYGENASE_3（リポキシゲナーゼ鉄結合型触媒ドメイン）が認められ、LOXの酵素活性に必須な非ヘム鉄の結合に重要である3つのヒスチジン残基が保存されていることが分かった。次に転写開始点を含む完全長cDNA配列を得るために、cDNA断片配列から遺伝子特異的プライマーを設計し、5’-および3’-RACEによる完全長cDNAクローニングを試みた。転写開始点の決定には、oligo-capping法を採用した。全RNAのCIPとTAP処理とそれに続くT4 RNA ligaseによる合成オリゴの導入後、逆転写反応に供することで5’-キャップ構造を持つ完全長mRNAのみからRACE-ready cDNAを構築した。

Fish species are classified into two groups: LOX and cDNA. The cDNA library of Elongation Factor (EF-1α) was constructed for the analysis of fish gene expression. Marine fish RNA extraction, reverse transcription and DNA synthesis LOX is used for the first time in the structure of mammals, and some fish are used for the first time in the structure of mammals. EF-1α is designed for use in mammals and yeast. RT-PCR was successful in identifying cDNA fragments of EF-1α in mammals. PROSITE is used to detect the presence of LOX fragments in fish and to detect the presence of LIPOXYGENASE_3 (iron-binding catalyst) in fish. It is recognized that LOX enzyme activity is essential for the preservation of non-iron-binding residues. Next, the start point of writing contains the complete long cDNA sequence, the cDNA fragment sequence, the gene specific sequence, the 5 '-RACE sequence, and the complete long cDNA sequence. To determine the starting point of writing, the oligo-capping method is adopted. Total RNA CIP and TAP processing include T4 RNA ligase synthesis, reverse transcription, reverse transcription, and RACE-ready cDNA construction.