逆行遺伝学的手法によるWaardenburg症候群原因遺伝子の単離

使用逆行遗传学方法分离导致瓦登堡综合征的基因

• 批准号: 04454540
• 负责人: 新川 詔夫
• 金额: --
• 依托单位: Nagasaki University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (B)
• 财政年份: 1992
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1992 至 1994
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-04454540/
• 关键词: ワールデンブルク症候群; 原因遺伝子単離; 遺伝子マッピング; isoform; alternative splicing; 組織特異的発現; マウスPax3; ヒトHuP2

1)研究当初までに単離されたDNAはHuP2遺伝子の1部分なので、その配列からprimerを作成し、ヒトcosmid libraryのscreeningにより8個の陽性clonesを得た。 2)このcosmidをprobeとしたPFGEーサザン解析で、2個のclones(WSIー15a、WSIー22)が2q35と2q37.3に逆位をもつWaardenburg症候群I型患者DNAに異常断片を検出したので、これらは患者の逆位切断点を認識し切断点を含むことが判明した。 3)患者染色体上でのFISH解析の結果、WSIー15aは切断点両方にsignalsを検出し丁度切断点を中央部にもつcloneであった。一方、WSIー22は2q35のみにsignalを検出した。 4)両clonesの制限酵素地図を作成したところ、WSIー15aはHuP2遺伝子のexon2より約10kb下流の切断点から異なる配列になっていた。この結果はHuP2がWSIの原因遺伝子と確定でき、またその座は2q35であることを示す。 5)次に、HuP2の全構造を明らかにするために、HuP2ーcDNAを取得した。ヒト成人小脳の5'と3'RACE librariesを構築し、総計24個の陽性clonesを得た。このうち3'RACE由来cloneはマウスPax3遺伝子と相同であり、985bpと578bpの2種に分かれた。前者をHuP2A、後者をHuP2Bと命名した。 6)HuP2AとHuP2Bの配列を決定し、exonーintron構造を明らかにした。HuP2Aは全長1248bpで4個のexons、215個のアミノ酸からから、HuP2Bは全長840bpで5個のexons、206個のアミノ酸から成っていた。両者は717bpを共有しこの領域のアミノ酸はPax3と100%の相同性を示したが、HuP2Aの197-215、HuP2Bの197-206のアミノ酸はPax3とは異なっていた。この結果は両cDNAは同一の遺伝子から異なったsplicingにより生じたisoformsであることを示す。 7)Pax3のexon5に相当する54bpのRT-PCR産物はヒト組織では発現していないので、それに相当するヒト領域がないことを示す。 8)HuP2の組織特異的発現をRTーPCRで調べた。HuP2Aはほとんどの組織で発現していたが、HuP2Bは小脳・食道・骨格筋でのみ発現していた

1)In this study, 8 positive clones were obtained from a single fragment of HuP2 gene, and a single fragment of HuP2 gene. 2) The cosmid probe was analyzed by PFGE and 2 clones(WSI 15a, WSI 22) were identified by DNA inversion in Waardenburg syndrome type I patients. 3)FISH analysis results on patient chromosomes, WSI-15a, reverse cut point, reverse cut point. One side, WSI-22, 2q35, and the other side signal. 4) The restriction enzyme of clones was prepared by WSI-15a, HuP-2 gene exon2, about 10kb downstream cut point, different alignment. The result is that HuP2 and WSI are the cause of the problem. 5)The complete structure of HuP2 was obtained. The adult 5'and 3'RACE libraries were constructed and a total of 24 positive clones were obtained. 3'RACE is derived from clone The former HuP2A and the latter HuP2B are named. 6)HuP2A and HuP2B are arranged in different directions, and the exon-intron structure is clearly defined. HuP2A has 4 exons and 215 exons, HuP2B has 5 exons and 206 exons. The 717bp domain is shared by the Pax3 and 100% identity is shown by the Pax3, HuP2A and 197-215, HuP2B and 197-206. The result is that the cDNA is identical to the original cDNA. 7) Exon5 of Pax3 corresponds to a 54bp RT-PCR product. 8) Tissue-specific expression of HuP2 was detected by RT PCR. HuP2A, HuP 2B, HuP 2A, HuP 2A, HuP 2B, HuP 2B, HuP 2A, HuP2B, HuP 2A, HuP2B, HuP2B, HuP 2A, HuP 2B, HuP 2A, HuP 2A, HuP2B, HuP 2A, HuP 2B, HuP 2B, HuP 2A, HuP 2A, HuP 2B,

项目成果

Tsukamoto K,Nakamura Y,Niikawa N: "Isolation of two isoforms of the HuP2 gene traus cripts and their tissue-specific altcenative expression in human adult tissues" Human Molecular Genetics. (1993)

Tsukamoto K、Nakamura Y、Niikawa N：“HuP2 基因 traus cripts 的两种亚型的分离及其在人类成人组织中的组织特异性替代表达”人类分子遗传学。

塚元 和弘、新川 詔夫: "Waardeuburg 症候群1型の原因遺伝子" 蛋白・核酸・酵素「ゲノム解析研究」. 38. 361-365 (1993)

Kazuhiro Tsukamoto、Akio Shinkawa：“Waardeuburg 综合征 1 型的致病基因”蛋白质、核酸和酶“基因组分析研究”38. 361-365 (1993)。

Hirota T,Tsukamoto K,Dong H-X,et al.: "Microdissection of human chromosomal vegious 8q23,3-q24,11and 2q33-qter:Construction of DNA libraries and isolation of their clones." Gcuomics. 13. 349-354 (1992)

Hirota T、Tsukamoto K、Dong H-X 等人：“人染色体植物 8q23、3-q24、11 和 2q33-qter 的显微解剖：DNA 文库的构建及其克隆的分离。”

Tsukamoto K,Tohma T,Ohta T,et al.: "Cloning and cheracterization of the inversion breakpoints at cheomosome 2q35 n a patient with Waardenburg syndrome type 1." Human Molecular Genetics. 1. 315-317 (1992)

Tsukamoto K、Tohma T、Ohta T 等人：“1 型 Waardenburg 综合征患者化学体 2q35 反转断点的克隆和表征。”