多発性外骨腫(がん抑制遺伝子のポジショナルクローニングと発がん機構

多发性外生骨疣（抑癌基因的定位克隆及致癌机制）

• 批准号: 06280226
• 负责人: 新川 詔夫
• 金额: $ 2.69万
• 依托单位: Nagasaki University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1994
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1994 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-06280226/
• 关键词: 多発性外骨腫; 遺伝子; ポジショナルクローニング; 染色体転座; 3′RACE法; 遺伝子発現; RT-PCR; 軟骨細胞

1.t(8q;13q)転座切断点付近のコスミドコンティングの作製:前年度までに切断点付近にマップしたYACのsubcloningを行ない,切断点を含む4.2kb-EcoRI断片を基にしたscreeningで6個のcosmidを取得した.この6個に関してT3/T7プロモーター配列を含むEooRI断片を用いたサザン解析によりcontigを作製した.うち4個(cyk8-238,3-2A,cyk8-12,cyk8-163)を以下に用いた.2.部分的cDNAの単離と対応するゲノムDNAの解析:上記のcosmidDNAをSau3AIで部分消化後1-3kb断片をexon trapping vector(pSPL1)に挿入し大腸菌(DHα)にtransfectし,vectorを回収後Cos7細胞にtransfectし細胞質RNAを回収しRT-PCRを行なった.4個のexon様DNA断片を得た.次いでこの4個の配列からpnimerを合成し,種々の組織由来の全RNAを用いて3′RACEを行なった.RACE産物をその内部オリゴDNAをプローブとしてサザン解析し,K37と219で陽性シグナルを得た.K37(cyk8-12由来)は精巣で,K219は前立腺で優位に発現していた.K37の3′RACE解析で2種の産物を得た.塩基配列の比較で3′側配列が異なっていたので,alternative splicingによる転写物だと考えた.この2種の3′RACE産物の共通配列と,K37配列を基に各々のprimer(CD37RとK37F2)を作製し,種々の組織由来RNAとゲノムDNAのPCR増幅を行なった.精巣RNAとゲノムDNAでは各々123bp産物と265bp産物を認めたため,142bpのイントロンの存在が示唆された.123bpのRT-PCR産物をprobeとしたノザン解析ではシグナルが検出できなかったので,精巣RNAを用いて3′RACEと5′RACEを行ない,cDNA全長の単離を試みた.3′RACEの結果は,上述の2種の転写物の存在が予想されたが,exon7/8の位置関係はまだ不明である.5′RACEの結果,exon1/2は各々反復配列L1とAluであった.3.CD37の軟骨細胞での発現:軟骨組織ではprimer(K37F1/CD37R)を用いたRT-PCRで産物を認めたが,exon1から作製したRACFA1とCD37RによるRT-PCRでは産物を得ることができなかった.

1.t (8q; 13q) 転seat cut off point pay close to のコスミドコンティングの production: previous year までに cut off point pay close to にマップしたYAC のsubcloning を行ない, cut Breakpoint を contains 4.2kb-EcoRI fragment をbase にしたscreening で6 のcosmid をobtained した. Containing EooRI fragments, 4 pieces (cyk8-238, 3-2A, cyk8-12, cyk8-163) were produced using いたサザン analysis and によりcontigを. The following is used. 2. Partial cDNA isolation and DNA analysis: 1-3kb fragment after partial digestion of cosmidDNA Sau3AI mentioned above. trapping The vector (pSPL1) was inserted into Escherichia coli (DHα) and transfected, and the vector was recovered and the cytoplasmic RNA of Cos7 cells was recovered. RT-PCR を行なった.4のexon様DNA fragmentsをgetた.Timesいでこの4のalignmentからpnimerをsynthesisし,kind々のorganismのwholeRNAを Useいて3′RACEを行なった.RACE product をその internal DNA をプローブとしてサザンanalysisし, K37と219でpositiveシグナルをgetた.K37(cyk8-12 origin)は精巣で, K219 has a superior position in the anterior prostate and is now in the right position. K37 has 2 kinds of products analyzed by 3′ RACE. Comparison of the base arrangement and the 3′ side arrangement are different and different, alternative. splicingによる転物だとtestえた.この2 kinds of 3'RACE products have a common arrangement, K37 arrangement has a base and each has a primary er(CD37RとK37F2)をproducedし,seed々のtissue originRNAとゲノムDNAPCR amplificationを行なった.sensible RNAとゲノムDNAではeach has a 123bp product and a 265bp product, and the 142bp product has a 123bp product. pのRT-PCR product をprobe としたノザン analysis ではシグナルが検できなかったので, sperm RNA を use いて 3'RAC Eと5′RACEの行ない, cDNA full-length test and results. 3′RACE results, the existence of the above two kinds of writings and thoughtsたが,exon7/8のpositional relationshipはまだUnknownである.5′RACEのresult,exon1/2はeach々repeatedly arrangedL1とAluであった.3.CD37 chondrocyte detection: Cartilage tissue primer (K37F1/CD37R) was produced using いたRT-PCR Material recognition, exon1 production, RACFA1 CD37R, RT-PCR product, exon1 production.