ヒト染色体ディセクションによる外骨腫(がん抑制)遺伝子単離と腫瘍抑制機構

通过人类染色体解剖分离外生骨疣（抑癌基因）基因及抑癌机制

• 批准号: 02262103
• 负责人: 新川 詔夫
• 金额: $ 5.76万
• 依托单位: Nagasaki University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1990
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1990 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-02262103/
• 关键词: 染色体ミクロ切断; がん抑制遺伝子; 外骨腫遺伝子; 遺伝子クロ-ニング; in situ hybridization

<1.染色体顕微鏡切断・微量DNAクロ-ニング法の改良>___ー:(1)染色体標本作製時における短時間細胞固定および迅速分染、(2)切断片の乾燥状態での集積と微量(1nl)のproteinase K溶液・phenol/chloroformを用いたDNA抽出法の導入、(3)制限酵素NlaIIIに代わるSau3AIの採用による染色体DNAの消化、(4)染色体Sau3AI断片5'端に相補的な10mer linkerとそれに相補的な20mer primerの導入によるPCR、(5)psoralenー紫外線照射法の開発による汚染DNA混入防止、などの新しい手法の導入あるいは開発により、(1)では従来の染色体作製方法において生ずる染色体DNAの脱プリンやnickingを最小限に抑えること、(2)ー(5)ではクロ-ン取得効率の増大、PCR前及びその最中に生ずる汚染あるいは由来不明DNA混入を減少させることが可能になった。<2.クロ-ンが8番染色体由来であることの検証>___ー:46個のクロ-ンをランダムに選択しプロ-ブとして、サザン法によりヒト全ゲノムDNA、ヒト8番染色体のみを含むヒト・マウス雑種細胞、およびマウス細胞とのhybridizationシグナルを調べた。46個中9個のクロ-ンでシグナルを検出した。うち6個はsingleーcopy DNAで、残りはrepetitive DNAであった。8q23ーq24のdissectionで得たPCR産物(2ug)をbiotinated duTPでラベルし、100ー500倍量のヒト全ゲノムDNAとの競合hybridizationの後、染色体上でfluorescence in situ hybridizationを行い、avidinーFITCと結合させた。8q23ーq24部位にFITCスポットを検出した。即ち、これらのクロ-ンは外骨腫遺伝子断片を含んでいる可能性が高い。<3.陽性クロ-ンを用いたヒトゲノムDNAライブラリ-のスクリ-ニング>___ー:上記の陽性クロ-ンをプロ-ブにして、プラ-クhybridizationを行った。10万個のプラ-ク中陽性シグナルを2個に認めた。現在、このクロ-ンを用いてTRPS患者DNAを解析中である。

< 1. The chromosome 顕 micromirror, cut trace DNA ク ロ - ニ ン の グ method improved > ___ ー : (1) when the chromosome specimen cropping に お け る cells in short time fixed お よ び rapid dyeing, (2) the cut piece の dry state で の trace (nl) 1 set product と の proteinase (1) K solution · phenol/chloroformを was introduced by the を たDNA extraction method <e:1>, (3) the restriction enzyme NlaIIIに generation わるSau3AI <e:1> was digested by the による chromosome DNA thread, (4) the に 10mer at the 5' end of the Sau3AI fragment of the chromosome was supplemented linkerとそれに the complementary な20mer Primer の import に よ る PCR, (5) psoralen ー ultraviolet ZhaoSheFa の open 発 に よ る DNA mixed with prevent pollution and な ど の new し い gimmick の import あ る い は open 発 に よ り, (1) で は 従 to の chromosome cropping method に お い て raw ず る chromosome DNA の プ off リ ン や nicking を minimum に え suppression る ー こ と, (2) (5) で は ク ロ - ン の raised large working rate, PCR and before び そ の に in most ず る pollution あ る い は origin unknown DNA mixed with を reduce さ せ る こ と が may に な っ た. < 2. ク ロ - ン が 8-fold chromosome origin で あ る こ と の 検 certificate > ___ ー : 46 の ク ロ - ン を ラ ン ダ ム に sentaku し プ ロ - ブ と し て, サ ザ ン method に よ り ヒ ト full ゲ ノ ム DNA, ヒ ト 8-fold chromosome の み を containing む ヒ ト · マ ウ ス 雑 cells, お よ び マ ウ ス cells と の hybridization シ グ ナ Youdaoplaceholder1 を key べた. Nine out of 46 た ロ ロ- でシグナ でシグナ を検 を検 を検 を検 を検 を検 た た. Youdaoplaceholder0 6 single うち copy DNAで, residual <s:1> repetitive DNAであった. 8q23 and <s:1> q24 <s:1> dissectionで obtained たPCR product (2ug)をbiotinated duTPでラベ <s:1>, 100 to 500 times the amount of <s:1> ヒト all ゲノムDNAと と after <s:1> hybridization, でfluorescence in situ on the chromosome hybridizationを lines を and avidin <s:1> FITCと binds させた. Position 8q23 に q24 にFITCスポットを検 out た. That is, the ち, <s:1>, れら, <s:1>, ロ, ロ, <s:1>, 伝 fragment を of the external bone tumor 伝 has a が high possibility of んで and る る. < 3. Positive ク ロ - ン を with い た ヒ ト ゲ ノ ム DNA ラ イ ブ ラ リ - の ス ク リ - ニ ン グ > ___ ー : written の positive ク ロ - ン を プ ロ - ブ に し て, プ ラ ク - hybridization を line っ た. Among 100,000 <s:1> プラ- めた, 2 に recognize めた are positive シグナ に を を を. Now, ロ ロ- を を is used to analyze である in the DNAを of TRPS patients with て て.

项目成果

Niikawa,N.,Deng,HーX.,Abe,K.,Harada,N.,et al.: "Possible mapping of the gene for transient myeloproliferative syndrome at 21q11.2." Human Genetics.

Niikawa, N.、Deng, H-X.、Abe, K.、Harada, N. 等人：“21q11.2 短暂性骨髓增殖综合征基因的可能定位。”

新川 詔夫 (分担執筆): "がんのバイオサイエンス" 東京大学出版会, (1991)

Akio Shinkawa（撰稿人）：《癌症生物科学》东京大学出版社，（1991 年）

新川 詔夫: "PCRの原理とその応用ーPCRを利用した微量DNA材料からのクロ-ニング:マイクロディセクションで得た染色体DNAからのクロ-ニング" Cell Science. 6. 377-383 (1990)

Akio Shinkawa：“PCR 原理及其应用 - 使用 PCR 从微量 DNA 材料中克隆：通过显微切割获得的染色体 DNA 进行克隆”《细胞科学》6. 377-383 (1990)。

Hamabe,J.,Harada N,Abe K,Fukushima Y,et al.: "A molecular study of the PrederーWilli syndrome:Deletion,RFLP and phenotype analyses on 50 patients." American Journal of Medical Genetics.

Hamabe, J.、Harada N、Abe K、Fukushima Y 等人：“Preder-Willi 综合征的分子研究：对 50 名患者的缺失、RFLP 和表型分析。”

陣野 吉廣,新川 詔夫: "PCRを用いた染色体特定領域DNAの直接クロ-ニング法ーmicrodissectionーmicrocloning法ー" 実験医学. 8. 1052-1057 (1990)

Yoshihiro Jinno、Akio Shinkawa：“使用 PCR 在特定染色体区域直接克隆 DNA 的方法 - 显微切割 - 微克隆方法”实验医学 8. 1052-1057 (1990)。