ヒト染色体ディセクションによる外骨腫(がん抑制)遺伝子単離と腫瘍抑制機構

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<1.染色体顕微鏡切断・微量DNAクロ-ニング法の改良>___ー:(1)染色体標本作製時における短時間細胞固定および迅速分染、(2)切断片の乾燥状態での集積と微量(1nl)のproteinase K溶液・phenol/chloroformを用いたDNA抽出法の導入、(3)制限酵素NlaIIIに代わるSau3AIの採用による染色体DNAの消化、(4)染色体Sau3AI断片5'端に相補的な10mer linkerとそれに相補的な20mer primerの導入によるPCR、(5)psoralenー紫外線照射法の開発による汚染DNA混入防止、などの新しい手法の導入あるいは開発により、(1)では従来の染色体作製方法において生ずる染色体DNAの脱プリンやnickingを最小限に抑えること、(2)ー(5)ではクロ-ン取得効率の増大、PCR前及びその最中に生ずる汚染あるいは由来不明DNA混入を減少させることが可能になった。<2.クロ-ンが8番染色体由来であることの検証>___ー:46個のクロ-ンをランダムに選択しプロ-ブとして、サザン法によりヒト全ゲノムDNA、ヒト8番染色体のみを含むヒト・マウス雑種細胞、およびマウス細胞とのhybridizationシグナルを調べた。46個中9個のクロ-ンでシグナルを検出した。うち6個はsingleーcopy DNAで、残りはrepetitive DNAであった。8q23ーq24のdissectionで得たPCR産物(2ug)をbiotinated duTPでラベルし、100ー500倍量のヒト全ゲノムDNAとの競合hybridizationの後、染色体上でfluorescence in situ hybridizationを行い、avidinーFITCと結合させた。8q23ーq24部位にFITCスポットを検出した。即ち、これらのクロ-ンは外骨腫遺伝子断片を含んでいる可能性が高い。<3.陽性クロ-ンを用いたヒトゲノムDNAライブラリ-のスクリ-ニング>___ー:上記の陽性クロ-ンをプロ-ブにして、プラ-クhybridizationを行った。10万個のプラ-ク中陽性シグナルを2個に認めた。現在、このクロ-ンを用いてTRPS患者DNAを解析中である。