GTP結合蛋白質によるミオシン軽鎖脱リン酸化酵素(MLCP)活性調節の解明

阐明 GTP 结合蛋白对肌球蛋白轻链去磷酸化酶 (MLCP) 活性的调节

• 批准号: 05670088
• 负责人: 森井 成人
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1993
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1993 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-05670088/
• 关键词: ミオシン軽鎖フォスファターゼ; rho蛋白質; GTP結合蛋白質; 蛋白質チロシンリン酸化; チロシンキナーゼ; ADPリボシル化; 情報伝達

平滑筋スキンド標本を用いた解析系でGTP依存性のCa感受性の亢進がrho蛋白質の特異的ADPリボシル化酵素であるC3酵素によって阻害されることから、rho蛋白質を介するMLCPの活性調節の可能性が考えられた。そこで今回、非筋細胞ホモジネートを用いて無細胞系で解析した。予め[^<32>P]ATPでリン酸化した砂嚢筋ミオシン軽鎖を基質として、ラット脳、Swiss3T3線維芽細胞、血小板ホモジネートを用いて検討した。1mM以上のGTP,GDPの添加はMLCP活性の低下をもたらしたが、これ以下の濃度では明らかな活性変化は観察されなかった。rho蛋白質ならびに他のGTP結合蛋白質のKd値(10-50nM)を考慮すると要求するヌクレオチドが高濃度であること、両者の効果に差が認められないことから非特異的抑制であると考えられた。次に予めGTPあるいはGDPと結合させたrho蛋白質を添加し検討したがMLCP活性の変化は検出されなかった。以上の結果からrho蛋白質がMLCPの活性を直接担っている可能性は少ないと結論された。そこで培養Swiss3T3細胞をもちいてrho蛋白質の関与する蛋白質リン酸化調節について検討した。C3酵素の存在下で培養したSwiss3T3細胞(C3酵素処理細胞)と非処理細胞を調製し、rho蛋白質の活性化刺激因子であることが報告されているLysophosphatidic acid(LPA)で刺激した。今回、C3酵素処理によるチロシンリン酸化の変化を解析した。LPA刺激により増強するチロシンリン酸化蛋白質のうち分子量130-110K,88K,72K,43Kの蛋白質(群)のリン酸化がC3酵素処理で減弱した。これらの蛋白質のうちp130-110の1つはfocal adhesionキナーゼ(FAK)であり、p43KはMAPキナーゼ(ERK2)であることが判明した。また、C3酵素処理細胞では抗PI3キナーゼp85抗体で共沈する180Kのチロシンリン酸化蛋白質バンドの減弱とLPAによるPI3キナーゼの活性化の阻害が認められた。これより、刺激因子→膜受容体・G蛋白質→rho蛋白質→チロシンキナーゼの情報伝達系の存在が示唆された。

Smooth muscle fiber specimens are fermented using the specific ADP enzyme that analyzes GTP-dependent Ca sensitivity and enhances rho protein. It is possible to regulate the activity of C3 enzyme and MLCP by inhibiting the blocking of enzyme and rho protein. This chapter is based on the analysis of non-muscle cell-free cell lines using いて cell-free systems. To め[^<32>P]ATP でリンacidified した sand 嚢嫢ミオシン軽 lock を matrix として,ラット脳, Swiss3T3 fibroblasts, platelets, and ホモジネートを are used for いて検した. The addition of GTP and GDP above 1mM will reduce the activity of MLCP, and the concentration below 1mM will improve the activity of GTP and GDP. rho proteinならびにhisのGTP-binding proteinのKd value (10-50nM)をconsider the requirementsするヌクレThe high concentration of オチドがであること, the effect of the 両 is not the same as the difference in the effect and the non-specific inhibition of the められないことから non-specific inhibition. The time is めGTPあるいはGDPとbindingさせたrhoproteinをaddedし検したがMLCP activityの変化は検出されなかった. The above results are not directly related to the activity of rho protein and MLCP, and the possibility is not the same as the conclusion.そこでCultivation of Swiss3T3 cells をもちいてrho protein のrelated and するprotein リン acidification regulation について検した. Swiss3T3 cells cultured in the presence of C3 enzyme (C3 enzyme-treated cells) and non-treated cells were modulated, and the rho protein activation stimulating factor was reported to be stimulated by Lysophosphatidic acid (LPA). This time, C3 enzyme treatment is used to analyze the acidification and transformation of によるチロシンリン. LPA stimulates the strong acidification of protein (group) with molecular weight 130-110K, 88K, 72K, 43K, and the acidification of protein with C3 enzyme treatment weakens it.これらのproteinのうちp130-110の1つはfocal adhesionキナーゼ(FAK)であり, p43KはMAPキナーゼ(ERK2)であることが clarificationした.また、C3 enzyme treated cells and anti-PI3 キナーゼp85 antibody co-precipitated 180K のチロシンThe acidified protein バンドの weakens and LPA によるPI3 キナーゼのactivation is hindered and recognized められた.これより, stimulating factor→membrane receptor・G protein→rho protein→チロシンキナーゼのinformation 伝达行の性 が出憆された.

项目成果

N.Morii et al.: "rho-GAP of 28 KDa(GAP2),but not of 190 KDa(p190),requires Asp^<65> and Asp^<67> of rho GTPase for its activation." J.Biol.Chem.268. 27160-27163 (1993)

N.Morii 等人：“28 KDa (GAP2) 的 rho-GAP，但不是 190 KDa (p190)，需要 rho GTPase 的 Asp^<65> 和 Asp^<67> 才能激活。”

N.Kumagai et al.: "Lysophosphatidic acid induces tyrosine phosphorylation and activation of MAP-kinase and focal adhesion kinase in cultures Swiss 3T3 cells." FEBS Lett.329. 273-276 (1993)

N.Kumagai 等人：“溶血磷脂酸在 Swiss 3T3 细胞培养物中诱导酪氨酸磷酸化以及 MAP 激酶和粘着斑激酶的激活。”

M.Yamamoto et al.: "ADP-ribosylation of the rho gene product by botulinum C3 exoenzyme causes Swiss 3T3 cells to accumulate in the G1 phase of the cell cycle." Oncogene. 8. 1449-1455 (1993)

M.Yamamoto 等人：“肉毒杆菌 C3 外切酶对 rho 基因产物的 ADP 核糖基化导致 Swiss 3T3 细胞在细胞周期的 G1 期积累。”

T.Tminaga et al.: "Inhibition of PMA-induced,LFA-1-dependent lymphocyte aggregation by ADP-ribosylation of the small molecular weight GTP-binding protein,rho." J.Cell Biol.130. 1529-1537 (1993)

T.Tminaga 等人：“通过小分子量 GTP 结合蛋白 rho 的 ADP 核糖基化来抑制 PMA 诱导的 LFA-1 依赖性淋巴细胞聚集。”

N.Kumagai et al.: "ADP-ribosylation of rho p21 inhibits lysophosphatidic acid-induced protein phosphorylation and phosphatidylinositol 3-kinase activation in" J.Biol.Chem.268. 24535-24538 (1993)

N.Kumagai 等人：“rho p21 的 ADP-核糖基化抑制溶血磷脂酸诱导的蛋白质磷酸化和磷脂酰肌醇 3-激酶激活”J.Biol.Chem.268。