Rho蛋白質と神経細胞のリモデリングに関する研究

Rho蛋白与神经元重塑的研究

基本信息

批准号：
13041061
负责人：
中井淳一
金额：
$ 4.42万
依托单位：
Okazaki National Research Institutes
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至 2002
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-13041061/
关键词：
GFP Rho 低分子量G蛋白質バイオセンサー分子生物学

项目摘要

低分子量G蛋白質のRhoは細胞の形態や細胞膜のラッフリング、平滑筋の収縮、細胞凝集、細胞運動、細胞分裂を制御している蛋白質である。この研究は低分子量G蛋白質RhoAとそのRhoAのシグナル伝達経路に関与する蛋白(特にRho Kinase)の活性を生細胞でリアルタイムに視覚化し、低分子量G蛋白質とそのカスケードの機能をin vivoで解析することを目的としている。計画は2年度にまたがっており、本年度はRho Kinaseに加えて、RhoA蛋白質と相互作用をすることが知られているRhoGDI, Rhotekin, Citron K蛋白質をクローン化し、Rho蛋白質との相互作用を視覚化することを試みた。RhoGDIなどの蛋白質にYFPを付加した遺伝子を作成し、CFPを付加したRhoAの活性型変異体であるRhoA-V14または不活性型変異体であるRhoA-N19を同時に細胞に発現させCFPとYFPの間のFRET効果を指標に蛋白間の相互作用を観察した。その結果RhotekinにおいてRhoA-V14とRhoA-N19の間で少ないながらFRETの差が見られた。今後蛍光変化が大きくなるようにデザインを検討しDNAの配列を調節していく。また神経細胞での視覚化に応用していく。また本研究領域のメンバーである京都大学の根岸教授と共同研究を行うこととなり、細胞の突起形成に関与すると考えられている新規の低分子量G蛋白質Rnd2とその効果器であるRapostlinとの蛋白間の相互作用を同様の方法で観察した。この試し実験においてFRETの変化が観察されたので、今後Rnd2についても視覚化を進め、神経細胞の突起形成のメカニズムを明らかにしていく。

Rho是一种低分子量G蛋白，是一种调节细胞形态，细胞膜褶皱，平滑肌收缩，细胞聚集，细胞运动和细胞分裂的蛋白质。这项研究旨在可视化低分子量G蛋白RhoA及其参与活细胞中RhoA（尤其是Rho激酶）信号通路的蛋白的活性，并分析低分子量G蛋白及其级联反应的功能。该计划跨越了两年，除了Rho激酶外，我们还试图克隆Rhogdi，Rhotekin和Citron K蛋白（已知与RhoA蛋白相互作用），以可视化它们与Rho蛋白的相互作用。创建了一个基因，其中将YFP添加到诸如Rhogdi之类的蛋白质中，而RhoA-V14是RhoA-V14（添加了CFP的RhoA的活性突变体），或在细胞中同时表达了一种不活跃的突变体的Rhoa-N19，并且使用FRET效应CFP和YFP与YFP之间的FRET效应观察到了蛋白质之间的相互作用。结果，Rhoa-V14和Rhoa-N19在Rhotekin中的FRET差异很小。将来，我们将考虑设计并调整DNA序列，以使荧光变化将增加。它也将应用于神经元中的可视化。我们还与该研究领域成员的京都大学的Negishi教授进行了联合研究，并观察到了新型的低分子量G蛋白RND2的相互作用，该蛋白RND2被认为与细胞突出形成有关，其效应子Rapostlin通过使用类似的方法。由于在该实验中观察到了FRET的变化，因此我们将继续可视化RND2并阐明神经元突出形成的机理。