C型慢性肝炎発症機序の解明と細胞障害性T細胞の確率

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1.トランスジェニックマウスによるC型慢性肝炎発症機序の解明C型肝炎ウィルス(HCV)の芯(cone)をコードする遺伝子を導入したマウスが2系統得られ、HCV core mRNAの発現が確認され、HCV core蛋白の発現をウエスタンブロッテイングおよび蛍光抗体法で検討中である。2.MHC class I拘束性CTLの分離(1)エフェクター細胞(CTL)の分離と標的HCVcore蛋白の同定:HLA-A11拘束性ペプチドの予想モチーフをxVxxxxxx(x)K(9-10アミノ酸残基)とし、HCVのアミノ酸配列なかに存在するHLA-A11拘束性ペプチド(HCV-A11)を10ペプチド合成した。HLA-A2, A11, B35, B46をもつC型慢性肝炎患者の末梢血単核球(PBMC)を分離精製し、各々のHCV-A11ペプチドで刺激し、さらにT細胞性白血病由来株細胞Jarkat細胞(A3, A11, B7, B35, Cw3, Cw4, Bw6)で再刺激し、IL-2添加培養を行い、CTL Assayのエフェクター細胞とした。Jarkat細胞を当該のHCV-A11ペプチドと共に培養し、ペプチド標識を行ない、標的細胞とし、前記エフェクター細胞を加え、5時間Co-cultureし、LDH標識によるCTL assayキットで細胞障害性を検討した。標的細胞に対して細胞障害性を示すCTLが分離され、対応するHCVペプチドとして2種類のHLA-A11拘束性ペプチドCVQREKGGRKとEVILTHPITKが得られた。得られたCTLのクローニングと樹立を行なっている。(2)標的細胞の作製:ヒト肝癌由来培養株細胞HePG2とC型慢性肝炎患者(HLA-A2, A24, B-35, B-54, Cw3, Cw1)の肝生検由来肝組織をHVJを用いて融合し、ハイブリドIMY-4細胞を樹立した。この細胞は継代培養が可能であり、持続的にHCVを産生している。この細胞を標的細胞としてHLA-A2, A24のC型慢性肝炎患者のPBMCからHLA-12およびA24拘束性CTLの樹立を検討中である。