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平滑筋ミオシン線維を安定化させるミオシン結合蛋白の研究

稳定平滑肌肌球蛋白纤维的肌球蛋白结合蛋白的研究

基本信息

批准号：
07670100
负责人：
岡垣壮
金额：
$ 1.34万
依托单位：
Gunma University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1995
资助国家：
日本
起止时间：
1995 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-07670100/
关键词：
平滑筋ミオシン細胞骨格

项目摘要

平滑筋においてミオシン線維を安定化させる蛋白質を検索するため、ニワトリ砂嚢平滑筋より得た抽出液を種々の方法で分画しミオシン線維を安定化する活性を光学顕微鏡で観察しながら追跡した。その結果25kDaの蛋白質がこの活性に寄与していることがわかった。しかし通常ミオシンを抽出する方法では25kDa蛋白質の収量が極端に悪かったため、収量を上げる改良を行った。ニワトリ砂嚢を挽き肉にし低濃度のKClとATPでミオシンを抽出後、残屑に高濃度のKClとATPを加えてホモナイザーで細胞を破壊することにより25kDA蛋白質の抽出効率が格段に良くなることがわかった。これを硫安分画、DEAEイオン交換カラム、ハイドロキシアパタイトで分画するとほぼ均一な25kDa蛋白質が得られた。DEAEイオン交換カラムの段階での25kDa蛋白質はミオシン線維を安定化する活性が高かったが、ハイドロキシアパタイトの段階では活性が低下した。またDEAEイオン交換カラムでの25kDa蛋白質画分は波長260-280nmの吸光度が高く、ハイドロキシアパタイトでの画分では吸光度が低かったので、前者の画分は核酸を含んでいると考えられた。従って25kDa蛋白質が核酸と結合すると、そのミオシン線維安定化の機能が活性化されると予想される。砂嚢より得た非リン酸化ミオシンは生理的溶液条件下(0.1M KCl, 2mM MgCl_2, 1mM ATP)ではミオシン線維を形成しないが、精製した25kDa蛋白質を低濃度加えると、長さ約1-2μmのミオシン線維を形成した。さらに25kDa蛋白質の濃度を上げるとパラクリスタル様の巨大な構造物を生じ、ミオシンの溶液が白濁した。リン酸化ミオシンの場合には生理的溶液条件でもミオシン線維を形成するため、25kDa蛋白質の効果は顕著ではなかった。また25kDa蛋白質と非リン酸化ミオシンによって形成されたミオシン線維の形状を電子顕微鏡で観察すると、太さ、長さなど形態的にはリン酸化したミオシンの線維と同様であった。最近になってようやく1mg程度の25kDa蛋白質が得られるまでに収量が向上したので、この蛋白質の部分アミノ酸配列を決定中である。今後、クローニングにより全アミノ酸配列を決定し、またcDNAを大腸菌で発現して、これを抗原として抗体を作成する計画である。また発現蛋白質をもとにミオシン結合部位の同定とミオシン線維安定化のメカニズムを明らかにしていく予定である。

The method of extracting protein from smooth muscle tissue and stabilizing protein in smooth muscle tissue was studied by optical microscopy. The result is a 25kDa protein with a high activity. The method for extracting the 25kDa protein is usually improved by increasing the amount of protein. The extraction efficiency of 25kDA protein was good after extraction of low concentration of KCl and ATP, and after extraction of high concentration of KCl and ATP from residue. The protein was isolated from a mixture of sulfur, DEAE, and protein. The activity of the 25kDa protein in the DEAE protein exchange domain was higher than that in the DEAE protein exchange domain, while the activity in the DEAE protein exchange domain was lower. The absorbance of the DEAE protein spectrum at 260-280nm is high, and the absorbance of the DEAE protein spectrum is low. The absorbance of the DEAE protein spectrum is low. The 25kDa protein is expected to bind to nucleic acids and to function as a line stabilizer. Under physiological solution conditions (0.1M KCl, 2mM MgCl_2, 1mM ATP), the protein was purified to 25kDa at low concentration and about 1-2μm in length. The concentration of 25kDa protein increased rapidly, and the solution became cloudy. In the case of acidification, the formation of 25kDa protein in physiological solution conditions The 25kDa protein was observed by electron microscopy in the form of a non-acidified protein. Recently, the amount of 25kDa protein obtained was increased to 1mg, and the partial acid alignment of the protein was determined. In the future, we will determine the sequence of all amino acids, develop the cDNA of E. coli, and create the antibody. The protein binding sites are identified and the stability of the protein binding sites is determined.