プロテインホスファターゼ2Aの74KDa調節サブユニットδの構造と機能

蛋白磷酸酶2A 74KDa调节亚基δ的结构和功能

基本信息

批准号：
07680652
负责人：
碓井裕史
金额：
$ 1.41万
依托单位：
Hiroshima University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1995
资助国家：
日本
起止时间：
1995 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

1.ヒト赤血球サイトゾルより精製した分子量180,000のプロテインホスファターゼ2Aは,34kDaの触媒サブユニットαと63および74kDaの調節サブユニットβ,δを各1分子ずつ含有する。74kDaδサブユニットの部分アミノ酸配列を決定し,ヒト大脳皮質および骨髄cDNAライブラリーよりδサブユニットのcDNAを単離した。このcDNAは570残基のアミノ酸より構成される分子量66,138の蛋白質をコードしており,大腸菌に発現させるとδサブユニット特異抗体と反応する約74kDaの蛋白質が検出された。推定される1次構造にはAキナーゼおよびCキナーゼによるリン酸化コンセンサス配列,核移行シグナル,プロリンリッチ領域,プロリン・グルタミンくり返し配列が認められた。δサブユニットのmRNAは約2.9kbで成熟ラットの調べた全ての組織(脳,心臓,肺,肝臓,脾臓,腎臓,腸,精巣,骨格筋)で検出された。:2.成熟ラットにおけるδサブユニットの組織分布をウエスタンブロット法で調べた。赤血球,脳,肺,精巣,副腎,心臓,脾臓,腎臓,肝臓のサイトゾルにδサブユニット特異抗体と反応する72kDa蛋白質が検出され,この内,脳における含量が最も多かった。骨格筋,腸ではほとんど検出されなかった。3.δサブユニットの機能をホロ酵素α_1β_1δ_1の解離,再構成により解析した。部分精製したα_1β_1δ_1をヘパリン-セファロースカラムを用いてα_1β_1とδに分離した。両者を0.4M塩化ナトリウム存在下で氷中で混和すると,ホロ酵素が再構成された。各種リン酸化基質に対するα_1β_1のホスファターゼ活性はδが結合することにより20-64%抑制され,α_1β_1およびα_1β_1δ_1の分子活性から推定されたδの機能を裏付けた。

1。蛋白质磷酸酶2a，从人的红细胞胞质溶胶中纯化，包含34 kDa催化亚基α和63和74 kDa调节亚基β和δ。确定了74kDaδ亚基的部分氨基酸序列，并从人的脑皮质和骨髓cDNA文库中分离出δ亚基的cDNA。该cDNA编码一个分子量为66,138的蛋白质，由570个氨基酸组成，当在大肠杆菌中表达时，检测到大约74 kDa的蛋白质与δ亚基特异性抗体反应。推定的原代结构显示了通过A和C-双激酶，核转运信号，富含脯氨酸的谷氨酰胺重复序列的共有磷酸化序列。在成熟的大鼠（大脑，心脏，肺，肝，脾，肾脏，肠，睾丸，睾丸，骨骼肌，骨骼肌，骨骼肌肉）中检测到的所有组织中检测到δ亚基的mRNA。：2。通过蛋白质印迹研究了成熟大鼠中δ亚基的组织分布。在红细胞，脑，肺，睾丸，肾上腺，心脏，脾脏，肾脏，肾脏和肝脏的胞质中检测到72 kDa蛋白与δ亚基特异性抗体反应，其中含量是大脑中最高的。在骨骼肌或肠中几乎没有检测到它。 3。通过分离和重建全酶α_1β_1Δ__1分析δ亚基的功能。使用肝素 - 塞语柱将部分纯化的α_1β_1Δ_1分离为α_1β_1和δ。在有0.4m氯化钠的情况下，在冰中混合，可以重建全酶。 α_1β_1对各种磷酸化底物的磷酸酶活性通过δ的结合被20-64％抑制，证实了从α_1β_1和α_1β_1Δ1的分子活性估计的δ功能。