ネフロン各部における発現遺伝子のインデックス化によるセグメント特異的遺伝子の同定

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大阪大学細胞生体工学センターの大久保らが、各組織・細胞のmRNAから岡山/Bergの方法により直接プラスミドベクターにクローニング後、自動DNAシークエンス装置を用い約1000クローンのDNA配列をpoly A tailより上流約250bpまで同定し、遺伝子データベース内の既知の配列と比較することにより未知の遺伝子を含む遺伝子発現をインデックス化し同定する方法を開発した。本方法を用い現在までにmicro dissection法によりマウス腎臓から近位尿細管、inner medullary collecting duct (IMCD)を集め解析を終えている。解析した1000クローン中、近位尿細管において646種類また、IMCDにおいては960種類のmRNA発現を同定し、その相対的な発現量を決定した。Gene Bank等の遺伝子情報データベースを用いた検討の結果、近位尿細管では204種類が、IMCDでは194種類が既知のDNA配列と考えられた。他は現在までのところ未知の遺伝子である。また近位尿細管で特異的に発現しかつ、最も発現量が多いクローンは近位尿細管全mRNAの約2%を占めている事が明らかとなった。大久保らにより構築された他臓器あるいは細胞の同様のデータベースと比較することによりコンピュータ上でサブトラクションを行い、先ず近位尿細管に特異的に発現していると考えられる遺伝子群を同定した。複数種類について、Northern Blot法により腎臓特異的な発現を、in situ Hybridization法により腎皮質〜髄質外層における局在を確認した。ついで、マウス腎皮質mRNAより作成したcDNAライブラリーを用いてクローニングを行い、腎臓に主に発現する新しい遺伝子を同定した。