アデノ随伴ウイルスを用いた血友病インヒビター患者に対する遺伝子治療用ベクターの開発

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血友病AあるいはBインヒビターの治療に用いられるリコンビナント活性型第VII因子製剤(rFVIIa)は半減期が短いことから、その一定レベルの持続的な発現がインヒビター患者の出血予防となる可能性があり、FVIIaとして細胞外へ分泌されるメカニズムを持たせた治療用ベクターのデザインに着手した。平成14年度に、遺伝子工学的操作にてヒトFVIIcDNAをAAVベースのプラスミドに組み込み、さらに、FVIIが細胞外分泌時にFVIIaとなるべく、FXがfurin/PACEによりRKRというアミノ酸配列を認識しこの部位に作用し成熟FXとなる。このことを受け、RKRをコードする9塩基をFVII重鎖-軽鎖間に挿入しベクタープラスミドを作成した。平成15年度には、本ベクタープラスミドのRKR配列をダイレクトシークエンスにて確認するとともに、発現実験に先立ち、2種類の市販の抗FVIIポリクローナル抗体を準備し、抗原量測定のためのELISAを構築した。FVIIcDNAおよびFVIIcDNAにRKR配列を組み込んだ各々2つのベクタープラスミドを大量培養純化した。HEK293細胞を6穴プレートに準備し、2μg/wellのプラスミドDNAをリポフェクション法によりトランスフェクションした。数回のトランスフェクションを試みたが、培養72時間後においても有意なFVIIタンパクの発現は得られなかった。このことは、9塩基挿入が細胞外分泌の抑制を引き起こしたことが推測された。ELISAやトランスフェクションの方法にも改良の余地があると思われ、本研究期間内において提示できる結果は得られなかったが、期間終了後も上記を考慮しつつ課題に取り組む予定である。