S.mutans,S.sobrinusを選択的に溶解する溶菌酵素の研究

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昨年度の研究により、Streptococcus mutantsの産生する分子量107kDaの溶菌酵素をコードする遺伝子のクローニングおよび遺伝子欠損株の作製を行った。今年度では、His-tag融合したリコンビナントタンパクを大腸菌の系を用いて大量発現させ、目的の酵素の大量精製を試みた。その結果、大腸菌の菌体破砕画分からNi-NTAレジン精製後、疎水(Phenyl)クロマトグラフィーを行うことによりクマシーブルー染色で単一のタンパクバンドを得ることができた。収量も1リットルの培養液からおよそ10mgの標品が得られ、大量に精製を行う系が確立できた。また、得られた精製酵素を用いてS.mutansの精製ペプチドグリカンを消化し、消化産物についてアミン末端の増加および還元糖の増加を検討したところ、還元糖の増加が認められた。また、ペプチドグリカンの糖の構成成分であるN-acetylglucosamineとN-acetylmuramic acidの還元糖の増加を検討した結果、N-acetyl-muramic acidの増加が認められたことから、この溶菌酵素はmuraminidaseであることが明らかになった。この酵素の溶菌活性の至適条件を検討した結果、リン酸緩衝液中でpHが6前後でかつ100mM NaClおよび75mM CaCl_2存在下で最大の活性を持つことが明らかになった。得られた精製酵素を用いて種々の口腔レンサ球菌に対する溶菌活性を比較検討した結果、S.mutansおよびS.sobrinusに対しては強い活性を示したが、その他のレンサ球菌(S.sanguis, S.salivarius, s.mitis)にはほとんど活性が認められなかった。