器官培養法を用いた歯胚幹細胞の単離・同定と歯牙再生への応用

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平成16年度はcDNAサブトラクション法により検出した歯胚の発生初期に発現する遺伝子のうち、塩基配列をベースに予想される蛋白構造のモチーフから、細胞膜表面の受容体と予想される新規の因子について検討を行った。すなわち、この因子のcDNA構造を元に細胞外、細胞内のそれぞれのドメインを構成する蛋白の精製を行い、この蛋白を用いて抗体の作成に取りかかっている。細胞外ドメインに対する抗体が作成されれば、フローサイトメトリーやHoechist33342蛍光色素を用いた細胞分離法にて回収した細胞から、さらにこの因子を発現している細胞を抽出する事ができ、歯胚の基となる細胞(歯原性幹細胞)の単離・同定が可能となり、また細胞内ドメインに対する抗体を用いて、歯原性幹細胞の候補細胞での細胞内情報伝達の系を明らかにすることができる。したがってこの因子の構造的・機能的解析により歯胚再生への新たな段階へ研究を進める事ができる。Runx2/Cbfa1について、isoformの違いによる歯胚の発生・分化との関連を、器官培養法とアンチセンス法(S-ODN法)を組み合わせて検索を行い、タイプII/III Runx2/Cbfa1が歯胚の発生・発育・分化に関与していることを明らかにし、Boneに投稿である。また、我々がcDNAサブトラクション法により検出した歯胚形成に関連した遺伝子のうち、thymosin beta4(Tb4)、PGK-1についてin situ hydridization法による歯胚における発現状況を検索し、これらが歯胚の発生と分化に関連している事を明らかにした。特にTb4については、matrix metaloproteinase-2,-9の発現に関与している事を明らかにし、Histchemistry and Cell Biologyに投稿中である。PGK-1については、解糖系酵素であるにもかかわらず、歯胚を始め、胎生期の肝臓や肺に限局して発現が認められ、しかも未知の蛋白と複合体を形成している可能性をWestern blot法により見い出した。現在この未知の蛋白の検出を試み、複合体の機能解析を行っている。