mRNA結合タンパク質の機能を阻害するペプチドの創製と細胞現象への適用

抑制 mRNA 结合蛋白功能的肽的创建及其在细胞现象中的应用

基本信息

批准号：
14657581
负责人：
黒瀬等
金额：
$ 2.11万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至 2003
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-14657581/
关键词：
mRNA β1アドレナリン受容体 3'-非翻訳領域 RNA-タンパク質相互作用 AUF-1 キナーゼ

项目摘要

β1アドレナリン受容体(β1受容体)は、心臓での収縮力や心拍数の調節に関与している。交感神経系の興奮が長期にわたると、細胞は受容体数を減少させることで刺激の強さを減弱させようとする。この受容体数減少の過程には、少なくとも受容体遺伝子の転写抑制ならびにmRNAの不安定化が寄与していると考えられている。特に心臓が心不全の状態に陥るとβ1受容体のみが選択的に減少することから、受容体のmRNAに選択的に作用し不安定化を引き起こすRNA結合タンパク質の寄与が推定されている。そこで、大腸菌の転写終結を利用したアッセイ系でRNA結合タンパク質とβ1受容体のmRNAとの相互作用を解析できる系を確立することを試みた。RNA結合タンパク質(AUF1、hnRNAP-β1およびHuR)をN-タンパク質との融合タンパク質として発現させ、一方β1およびβ2受容体の3'非翻訳領域をβ-ガラクトシダーゼの上流に置くと、両者が相互作用するときのみβ-ガラクトシダーゼ活性が観察される。また、RNA結合タンパク質とmRNAとの相互作用の強さは、β-ガラクトシダーゼ活性値と相関する。このアッセイ系を用いて、AUF1はβ1およびβ2受容体のいずれとも相互作用すること、しかしhnRNP-A1とHuRは両受容体と相互作用しないことが明らかになった。次に、RNA結合タンパク質とmRNAの結合がタンパク質キナーゼによって制御されている可能性を検討するために、β受容体刺激で活性が変化するとされるGSK3βを発現させた。GSK3βを発現させると、β1受容体との相互作用が減少したものの、β2受容体との相互作用は変化しなかった。今後、β1受容体のmRNAの不安定化が受容体刺激によって活性化されたGSK3βによるAUF1のリン酸化を介しているのか細胞レベルで検討し、心不全時の選択的なβ1受容体の減少のメカニズムにつなげたい。

β1肾上腺素能受体（β1受体）参与调节收缩力和心脏的心率。当扩大交感神经系统激发时，细胞试图通过减少受体数量来减轻刺激的强度。人们认为，受体基因的至少转录抑制和mRNA的不稳定有助于减少受体数量。特别是，当心脏陷入心力衰竭状态时，只有β1受体被选择性地降低，并且已经考虑了选择性作用于受体mRNA并导致不稳定的RNA结合蛋白的贡献。因此，我们试图建立一个可以使用用于大肠杆菌中转录终止的测定系统来分析RNA结合蛋白和β1受体的mRNA之间相互作用的系统。当RNA结合蛋白（AUF1，HNRNAP-β1和HUR）表示为与N蛋白的融合蛋白时，而β-galactosidase酶的3'未翻译区域仅在两者相互作用时才能在β-半乳糖苷酶活性的β-半乳糖苷酶活性上放置。此外，RNA结合蛋白与mRNA之间相互作用的强度与β-半乳糖苷酶活性值相关。使用此测定系统，据揭示了AUF1与β1和β2受体相互作用，但是HNRNP-A1和HUR与两个受体没有相互作用。接下来，为了检查RNA结合蛋白和mRNA的结合受到蛋白激酶的调节，GSK3β被认为在β受体刺激时改变了活性。 GSK3β的表达降低了与β1受体的相互作用，但没有改变与β2受体的相互作用。将来，我们将研究是否通过在细胞水平的受体刺激激活的GSK3β介导β1受体mRNA的稳定，我们要研究AUF1的mRNA不稳定AUF的稳定是否是由受体刺激介导的，并导致心脏衰竭期间β1受体选择性减少的机制。