セグメント特異的同位体ラベルP450を用いた電子伝達相互作用部位の解明

使用片段特异性同位素标记 P450 阐明电子传递相互作用位点

• 批准号: 14658217
• 负责人: 石森 浩一郎
• 金额: $ 1.22万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-14658217/
• 关键词: チトクロムP450; 電子伝達反応; NMR

チトクロムP450は炭化水素の特定部位を水酸化する酵素で,その温和な反応条件と反応位置の特異性から酵素化学的だけではなく,実用的,工業的にもその応用が注目されている.この酵素の水酸化反応においての解明するべき点の一つは,分子状酸素の活性化に必要な電子の供給機構であり,この電子伝達機構が解明され,その人工的制御が可能になればこの酵素の応用範囲が大きく広がることが期待される.本研究課題ではこのチトクロムP450における電子伝達機構の解明とその制御を目指して,NMRとペプチド鎖の同位体置換を組み合わせることで,代表的なチトクロムP450であるd-カンファーを基質とする緑膿菌のチトクロムP450(P450cam)と,その電子供与体であるプチダレドキシン(Pd)の電子伝達相互部位の決定,およびその電子伝達過程の制御機構について検討を行った.本研究で得られた主な結果は以下のとおりである.1.P450camのNMRスペクトルを詳細に検討し,基質であるd-カンファーやヘム近傍に位置するスレオニン252に由来するNMRシグナルの帰属に成功した.2.今回帰属したNMRシグナルを用いて電子供与体であるPdの結合によるP450camのヘム近傍の構造変化を検討し,Pd結合によりヘム面が傾き,ヘム鉄とd-カンファーとの距離が短くなることを見出した.このことは,ヘム鉄上で生成する活性酸素を効率的にd-カンファーに転移させる上で有利であると考えられた.3.電子伝達相互作用部位と想定される領域を含むP450camのアミノ酸配列が無細胞系でも合成できることを示し,セグメント特異的同位体ラベルがP450camでも可能であると考えられた.しかし,実際のセグメント特異的同位体ラベルP450camの作製のためには,この配列の収率は低く,更なる反応条件の検討が必要であった.

P450 is an enzyme that acidifies specific sites of carbonitride, mild reaction conditions, site specificity, enzyme chemistry, practical, industrial, and industrial applications. The enzyme's hydrolysis process is characterized by the existence of an electron supply mechanism necessary for the activation of molecular acids, and the existence of an electron transfer mechanism for the activation of molecular acids. This research topic refers to the determination of electron transfer interaction sites in the electron donor P450(P450cam) and electron donor Pd (Pd). The control mechanism of the electronic transmission process is discussed in detail. The main results obtained in this study are as follows: 1. The NMR spectrum of P450 cam was investigated in detail, and the matrix was successfully analyzed. 2. The NMR spectrum was successfully analyzed. 3. The NMR spectrum was successfully analyzed. The distance between them is short. 3. Electron transfer interaction site: The domain containing P450cam and acid alignment: Cell line free synthesis: The domain containing P450cam and acid alignment: Cell line free synthesis: The domain containing P450 cam and acid alignment: Cell line free synthesis: Cell line free synthesis: Cell line specific: Cell line free synthesis: Cell line free In fact, it is necessary to investigate the reaction conditions for the production of P450cam.

项目成果

Tosha, T. et al.: "Molecular Mechanism of Electron Transfer Reaction in Cytochrome P450_<cam>-Putidaredoxin : Roles of Gln360 at the Heme Proximal Site"Biochemistry. 41. 13883-13893 (2002)

Tosha, T. 等人：“细胞色素 P450_<cam>-Putidaredoxin 中电子转移反应的分子机制：Gln360 在血红素近端位点的作用”生物化学。