核タンパク質の核内移行活性の制御とタンパク質リン酸化反応の関係に関する研究

核蛋白入核活性调控与蛋白磷酸化反应的关系研究

• 批准号: 03833022
• 负责人: 米田 悦啓
• 金额: $ 1.09万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1991
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1991 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-03833022/
• 关键词: 核局在化シグナル; 合成ペプチド; タンパク質リン酸化; 核タンパク質輸送; タンパク質ソ-ティング; 核膜孔; 赤血球ゴ-スト法

SV40 large T抗原の核局在化シグナル(Nuclear Location Signal;NLS)とその周辺部を含む合計34個のアミノ酸残基からなる長い合成ペプチド(long Tペプチドと呼ぶ)を用いることにより、IgMのような巨大な分子をも核内に移行させることができることがわかった。従来は、NLSだけを含む合成ペプチドを結合させてもIgMのような巨大な分子は核に移行できず、NLSによって核内に入り得る核タンパク質の大きさに制限があると考えられていた。本研究で得られた上記の結果は、この概念を打ち破るもので、感染過程でのSV40ウィルス粒子の核への移行や、RNAポリメラ-ゼのような巨大なタンパク質複合体を形成している分子の核への移行のメカニズムを考える上で、重要な示唆を与えるものと思われる。このlong Tペプチドをウシ血清アルブミン(BSA)に結合させ、赤血球ゴ-スト法を用いて細胞内に導入すると同時に、32pーorthophosphateでタンパク質を標識して解析することにより、long Tペプチドが特異的にリン酸化を受けていることがわかった。リン酸化の効果をみるため、long Tペプチドの中で、リン酸化され得ると考えられる4個のSerine/Threonine残基をAlanineに置換させた変異型long Tペプチドを新たに作製した。これをIgMに結合させて核への移行を調べてみると、効率は低下するものの、IgMを核へ移行させる活性は保持されていた。また、上記と同じ方法を用いて、変異性long Tペプチドは実際にリン酸化を受けないことが確認された。さらに詳細に時間経過を追ってペプチドーIgM結合物インジェクション後の細胞内局在を観察したところ、変異型long TペプチドーIgM結合物は、野生型long TペプチドーIgM結合物と比べて、核膜周辺部で長時間留まっていることを示唆する結果が得られた。このことから、リン酸化は、核膜孔通過あるいは、その直前のステップでの効率に何らかの役割を果たすのではないかと推測される。

SV40 large T antigen in the Nuclear Location Signal (NLS), containing a total of 34 amino acid residues in the peripheral part of the long T complex (long T complex), the use of large molecules in the nuclear migration, IgM The NLS is composed of two parts: one part is composed of two parts: one The results of this study are as follows: the concept of SV40, the nuclear migration of SV40 particles, the RNA migration, the formation of giant SV40 complexes, the nuclear migration of SV40 molecules, the important indication, and the thought of SV40 particles. The long T protein was introduced into the cell using the BSA binding method, and the 32p orthophosphate was identified and analyzed by the BSA specific enzyme. 4 Serine/Threonine residues were replaced by 4 long T residues. The IgM binding activity is regulated and the IgM binding activity is maintained. The same method is used to identify the difference between the two methods. In addition, detailed time-lapse analysis was performed to observe the intracellular process after the injection of the long T receptor IgM conjugate. The results showed that the mutant long T receptor IgM conjugate was compared with the wild type long T receptor IgM conjugate, and the peripheral part of the nuclear membrane remained for a long time. The effect of the acid on the nuclear membrane pore is estimated.

项目成果

米田 悦啓: "核タンパク質の核内移行のメカニズム" ブレインサイエンス. 2. 495-497 (1991)

Etsuhiro Yoneda：“核蛋白的核输入机制”《脑科学》2. 495-497 (1991)。

今本 尚子: "蛋白質の核へのタ-ゲティングと局在化の分子機構" 実験医学. 9. 2196-2202 (1991)

Naoko Imamoto：“蛋白质核靶向和定位的分子机制”实验医学 9. 2196-2202 (1991)。

米田 悦啓: "タンパク質の核移行とそのシグナル" BlO medica. 7. 160-164 (1992)

Etsuhiro Yoneda：“蛋白质及其信号的核输入”BlO medica。7. 160-164 (1992)

今本 尚子: "核タンパク質の核内輸送機構" BlO medica. 6. 413-418 (1991)

Naoko Imamoto：“核蛋白的核转运机制”BlO medica。 6. 413-418 (1991)

Mitsuru Kido: "Escherichia coli Rec A protein modified with a nuclear location signal binds to chromosomes in living mammalian cells" Experimental Cell Research. 198. 107-114 (1992)

Mitsuru Kido：“用核定位信号修饰的大肠杆菌 Rec A 蛋白与活哺乳动物细胞中的染色体结合”实验细胞研究。