核局在化シグナル結合タンパク質の解析とそれに基づく核タンパク質輸送機構の解明

核定位信号结合蛋白的分析以及基于它们的核蛋白转运机制的阐明

• 批准号: 04833018
• 负责人: 米田 悦啓
• 金额: $ 1.22万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1992
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1992 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-04833018/
• 关键词: 核局在化シグナル; 熱ショックタンパク質; 核タンパク質輸送; 核タンパク質; マイクロインジェクション法; 核膜孔

これまで本研究者は、核タンパク質が核内に輸送されるために必要な配列である核局在化シグナルに特異的に結合するタンパク質として分子量69kDaの分子(p69)を同定し、完全精製することに成功していたわけであるが、その完全精製したp69の部分アミノ酸配列を決定したところ、熱ショックタンパク質の1つである70kDa heat shock cognate(hsc70)であることが明かとなった。精製hsc70に対する抗体を核タンパク質とともに培養細胞の細胞質にインジェクションすると、その核タンパク質の輸送は特異的に阻害された。さらに、この抗hsc70抗体の持つ阻害活性はヒトhsc70遺伝子を大腸菌で発現させて得られたhsc70タンパク質によって吸収されることから、hsc70に特異的であることが明かとなり、hsc70が核タンパク質の核内移行に重要な働きをしていることがin vivoで初めて示された。次に、hsc70の核タンパク質輸送における重要性を明確にし、その役割を明らかにするために、培養細胞をジギトニンで処理し、細胞質抽出液を反応系に加えるというsemi-intact細胞によるin vitro系を利用した。反応系に加えるべき細胞質抽出液を抗hsc70抗体を用いて処理し、hsc70を吸収した。hsc70を吸収した細胞質抽出液には核タンパク質を核内に輸送する活性はほとんどなく、精製hsc70を再添加することによりその活性は吸収前のレベルにまで回復した。このことから、hsc70が核タンパク質の輸送に関与していることがin vitro系において再確認された。さらに、このin vitro系において、核タンパク質の輸送が誘導された時、hsc70の局在がどうなるかを調べた。核タンパク質の核内への輸送がみられる条件下で細胞を固定し、間接蛍光抗体法を用いてhsc70の細胞内局在を調べたところ、核タンパク質と同様に核内に局在していた。このことからhsc70が核タンパク質と挙動を共にすることによって核タンパク質輸送に関与していることが示唆された。

The authors determined the molecular weight of a molecule (p69) of 69kDa in the nucleocapsid chain by determining the molecular weight of the molecule (p69) in the nucleocapsid chain and determining the molecular weight of the molecule (p69) in the nucleocapsid chain. 70kDa heat shock recognize (hsc70) hsc70 is a specific inhibitor of nuclear protein transport in cultured cells. In addition, the anti-hsc 70 antibody has sustained inhibitory activity against the hsc 70 protein, which is found in Escherichia coli. The hsc 70 protein is specific to the hsc70 protein, which is important for the nuclear translocation of hsc 70 protein. The importance of hsc70 in nuclear transport was clarified, and the use of cell culture in vitro was discussed. Anti-hsc 70 antibody was used to treat the cytoplasm extract of the anti-hsc 70 system, and hsc70 was absorbed. hsc70 is absorbed into the cytoplasm and transported into the nucleus. hsc70 is purified and re-added. hsc70 activity is recovered before absorption. This time, hsc70 was reconfirmed in the vitro system. In the meantime, the system of vitro is in the middle of the system, the core of the system is in the middle of the system, the core of the system is in the middle of the system, and the core of the system is in the middle of the system. Cell immobilization and indirect fluorescent antibody method were used to regulate the intracellular structure of hsc70 under the same conditions. This is the first time I've ever seen a person who's been in a relationship with a person who's been in a relationship with a person.

项目成果

Naoko Imamoto: "Antibodies against 70-kD heat shock cognate protein inhibit mediated nuclear import of karyophilic proteins" J.Cell Biology. 119. 1047-1061 (1992)

Naoko Imamoto：“针对 70-kD 热休克同源蛋白的抗体抑制介导的亲核蛋白的核输入”J.Cell Biology。

Yumiko Okuno: "70kD heat shock cognate protein colocalizes with karyophilic proteins into the nucleus during their transport in vitro" Experimental Cell Research.

Yumiko Okuno：“70kD 热休克同源蛋白在体外运输过程中与亲核蛋白共定位到细胞核中”实验细胞研究。

米田 悦啓: "核タンパク質の核内移行のメカニズム[IV]" ブレインサイエンス. 3. 413-415 (1992)

Etsuhiro Yoneda：“核蛋白的核输入机制[IV]”《脑科学》3. 413-415 (1992)。

Yoshihiro Yoneda: "Methods in Enzymology" Academic Press,Inc.,

米田义博：《酶学方法》学术出版社，

米田 悦啓: "タンパク質の核内移行とリン酸化" 生体の科学. 43. 277-280 (1992)

Etsuhiro Yoneda：“蛋白质的核输入和磷酸化”生物科学 43. 277-280 (1992)。