植物キチナーゼの構造と機能に関する研究

本研究は植物起源のキチナーゼを分離・精製し、その構造並びに構造機能相関を明らかにすることを目的とするもので、以下の成果を得た。I.ライ麦種子キチナーゼRSC-a(33kDa)とRSC-c(26kDa)について。(1)基質特異性:両酵素のグライコールキチン及びコロイダルキチンに対する作用を調べた結果、前者に対してはRSC-cがやゝ高い活性を示すが、後者に対してはRSC-aがRSC-cの3倍の活性を有し、それはRSC-aがそのN端ドメイン(4kDa)を介してコロイダルキチンに結合するためであることがわかった。また、(GlcNAc)nに対する作用から、両酵素はエンド型キチナーゼで、テトラマー以下は分解しにくいことがわかった。(2)活性に関与するアミノ酸残基:RSC-cの活性に及ぼす化学修飾の影響から、Arg,Tyr,His,Lys及びCys残基は活性に関与せず、Trp及びCOOH基が活性に関与することがわかり、活性残基としてTrp72及びAsp95(またはAsp232)を同定した。(3)プロテアーゼによる限定分解:RSC-a及びRSC-cの界面活性剤存在下、非存在下におけるプロテアーゼ分解実験から、トリプシン、V8プロテーアーゼ、サーモリシンは分解しないが、リジルエンドペプチダーゼはRSC-aを20kDa(N端領域)と10kDa(C端領域)に、RSC-cを12kDa(N端領域)と10kDa(C端領域)に限定分解することがわかった。II.キチナーゼの分離・精製及び性質について。(1)アメリカヤマゴボウ緑葉キチナーゼ:硫安塩析、ゲル濾過、イオン交換クロマト、疎水クロマト等を用い、塩基性キチナーゼ(27kDa,pI=9.5)及び酸性キチナーゼ(24kDa,pI=3.7)を單離し、その蛋白質化学的及び酵素化学的性質を明らかにした。(2)ギンネム種子キチナーゼ:上と同様にして、中性キチナーゼ(23kDa)を單離した。

本研究は植物起源のキチナーゼを分離・精製し、その構造並びに構造機能相関を明らかにすることを目的とするもので、以下の成果を得た。I.ライ麦種子キチナーゼRSC-a(33kDa)とRSC-c(26kDa)について。(1)基質特異性:両酵素のグライコールキチン及びコロイダルキチンに対する作用を調べた結果、前者に対してはRSC-cがやゝ高い活性を示すが、後者に対してはRSC-aがRSC-cの3倍の活性を有し、それはRSC-aがそのN端ドメイン(4kDa)を介してコロイダルキチンに結合するためであることがわかった。また、(GlcNAc)nに対する作用から、両酵素はエンド型キチナーゼで、テトラマー以下は分解しにくいことがわかった。(2)活性に関与するアミノ酸残基:RSC-cの活性に及ぼす化学修飾の影響から、Arg,Tyr,His,Lys及びCys残基は活性に関与せず、Trp及びCOOH基が活性に関与することがわかり、活性残基としてTrp72及びAsp95(またはAsp232)を同定した。(3)プロテアーゼによる限定分解:RSC-a及びRSC-cの界面活性剤存在下、非存在下におけるプロテアーゼ分解実験から、トリプシン、V8プロテーアーゼ、サーモリシンは分解しないが、リジルエンドペプチダーゼはRSC-aを20kDa(N端領域)と10kDa(C端領域)に、RSC-cを12kDa(N端領域)と10kDa(C端領域)に限定分解することがわかった。II.キチナーゼの分離・精製及び性質について。(1)アメリカヤマゴボウ緑葉キチナーゼ:硫安塩析、ゲル濾過、イオン交換クロマト、疎水クロマト等を用い、塩基性キチナーゼ(27kDa,pI=9.5)及び酸性キチナーゼ(24kDa,pI=3.7)を單離し、その蛋白質化学的及び酵素化学的性質を明らかにした。(2)ギンネム種子キチナーゼ:上と同様にして、中性キチナーゼ(23kDa)を單離した。