アデノウイルスベクターを用いた目的蛋白の新しい大量産生法の開発

开发利用腺病毒载体大规模生产靶蛋白的新方法

• 批准号: 06670320
• 负责人: 斎藤 泉
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1994
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1994 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-06670320/
• 关键词: ウイルスベクター; 遺伝子治療; リコンビナーゼ; Cre; HBs抗原; COS細胞; 複製起点

COS細胞とSV40の複製起点(ori)を併用した蛋白の大量発現系は広く研究室レベルで用いられているが、トランスフェクションによる遺伝子導入法では全細胞の10〜20%しか利用することができない。一方組換えアデノウイルスはCOS細胞を始めとして各種細胞へ高い遺伝子導入効率を示すが、直鎖状の遺伝子のため単独ではSV40系の正確な複製をおこす環状分子は生成しない。そこで組換えアデノウイルスと部位特異的リコンビナーゼCreを併用し、100%のCOS細胞へ複製可能な環状分子を導入する大量発現系(Ad-COS法)の確率を目的として研究を行った。Creは34bpのloxP配列を認識し、相同組換えに必要な一連の反応を単独で行うことが知られている。そこでSV40 oriと発現マーカーであるB型肝炎表面抗原(HBs)発現単位の両側にloxP配列をもつ組換えアデノウイルス(環状分子生成ウイルス)とCre発現組換えアデノウイルスを作成しCOS-1細胞へ同時感染した。その結果Creが発現することにより、環状分子生成ウイルス上のloxP配列で特異的な相同組換えを起こし、100%の細胞で設計どうりの環状分子が生成していたことがサザン法により明らかとなった。また生成した環状分子は3日目に最高500コピーにまで複製していた。Ad-COS法は、100%のCOS細胞へ複製可能な環状分子を導入する系であることが示されたので、従来のトランスフェクション法とAd-COS法での発現量をHBsのELISA法で測定し比較した。従来法は環状分子生成ウイルスと同じインサートを有するプラスミドをカルシウム法により遺伝子導入した。導入7日目までの発現蓄積量を比較したところAd-COS法では従来法の約5倍の発現量である8mg/リットルにまで達していることが示された。組換えアデノウイルスは神経や肝細胞等へも高い遺伝子導入効率を示すので、今後Ad-COS法とSV40T抗原発現組換えアデノウイルスを併用することで各種細胞における大量発現系の確立への発展性が示唆された。

COS cells and SV40 origin of replication (ori) co-expression of protein is the result of gene introduction method in the laboratory, the use of 10 ~ 20% of the whole cell. A group of cell types, such as COS cells, have been shown to be highly effective in introducing genes into the cells, and the SV40 cells have been shown to be highly effective in replicating genes The aim of this study is to investigate the accuracy rate of a large number of discovery systems (Ad-COS method) in which 100% of COS cells can replicate and introduce cyclic molecules in combination with site-specific Cre. Cre 34bp loxP alignment is recognized, the same composition is necessary, and the reverse is independent. In addition, SV40 and Cre can be found in COS-1 cells simultaneously infected with hepatitis B surface antigen (HBs). As a result, cyclic molecules are generated in 100% of the cells designed to generate cyclic molecules in the same way. The highest number of ring-like molecules is 500. Ad-COS method can replicate 100% of COS cells, and the amount of cyclic molecules introduced into the cells can be measured by ELISA method. The method for producing cyclic molecules is to introduce them into the system. The amount of discovery in the 7-day-old sample was about 8mg/kg compared with that in the Ad-COS sample. In the future, Ad-COS method and SV40T antigen production method will be used together to demonstrate the development of a large number of development lines in various cells.

项目成果

S.Harada et al.: "Establishment of a cell line constitatively expressing E2 glyeoprotein of hepatitis C virus and humoral responce・・・" J.Gen.Virol.(in press). (1995)

S.Harada 等人：“建立表达丙型肝炎病毒 E2 糖蛋白的细胞系和体液反应……”J.Gen.Virol.（出版中）。

H.Chang et al.: "Highly efficient adenovirus-mediated gene transfer into renal cells in culture" Kiduey international. 47. 322-326 (1995)

H.Chang 等人：“高效腺病毒介导的基因转移至培养物中的肾细胞”Kiduey International。

H.Sakamoto et al.: "Adenovirus-mediated transfer of the HST-1(FGF4) gene induced incheased levels of platelet count in vivo" Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 91. 12368-12372 (1994)

H.Sakamoto 等人：“腺病毒介导的 HST-1(FGF4) 基因转移导致体内血小板计数水平升高”Proc.Natl.Acad.Sci.USA。

鐘ヶ江裕美,他: "アデノウイルスベクターによる遺伝子導入" 実験医学(増刊),羊土社. 12. 1804-1810 (1994)

Hiromi Kanegae 等人：“使用腺病毒载体进行基因转移”实验医学（特别版），Yodosha，12. 1804-1810（1994）。

Y.Nakamura et al.: "Adoptive immunotherapy with murine tumor-specific T lyphocytes engineered to secrete interleurin 2" Cancer Research. 54. 5757-5760 (1994)

Y.Nakamura 等人：“采用经过改造的小鼠肿瘤特异性 T 淋巴细胞进行过继免疫治疗，以分泌白细胞介素 2”癌症研究。