副腎皮質のステロイド産生の細胞層特異性を決定づけるAP-1様転写調節蛋白質の精製

纯化一种 AP-1 样转录调节蛋白，该蛋白决定肾上腺皮质中类固醇生成的细胞层特异性

• 批准号: 06680624
• 负责人: 向井 邦晃
• 金额: $ 1.34万
• 依托单位: Keio University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1994
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1994 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-06680624/
• 关键词: 副腎皮質; ステロイドホルモン; シトクロムP-450; ミネラルコルチコイド; グルココルチコイド; 転写因子

前年度までにマウス副腎皮質由来のY1細胞をもちいた実験から、CYP11B1遺伝子の転写開始点の上流にAP-1様DNA結合蛋白質が結合すること、この配列がプロモーター活性に不可欠であることが明らかになった。今年度は、Y1細胞の核抽出液に見いだされたAP-1様転写調節蛋白質の同定とその作用機序を明らかにすることを目的として解析を進めたところ以下の結果が得られた。1.ゲルシフト法により、このDNA結合蛋白質はCYP11B1遺伝子のプロモーター領域には結合するが、副腎皮質の別の細胞層に発現するB2遺伝子のプロモーター領域には結合しないことが判明した。2.AP-1配列の3'側にAd4配列結合蛋白質(Ad4BP)が存在したが蛋白質の結合は認められなかった。Ad4配列はステロイド合成遺伝子の共通に働く正の転写調節蛋白質として知られている。AP-1配列とAd4配列の転写活性化機能を調べた。その結果、AP-1配列が必須である一方、Ad4配列には転写活性化能は認められなかった。3.Y1細胞の核抽出液はAd4BPを含むことが知られている。そこで、AP-1配列とAd4配列へのそれぞれの蛋白質の結合を、Y1細胞の核抽出液と2つの部位を含んだプロモーター配列をもつプローブを用いてゲルシフト法とフットプリント法により、詳細に調べたところ、AP-1の結合活性は、Ad4BPの結合活性に比べて少なくとも5倍強いこと、両者の結合は競争的で同時にそれぞれの部位へ結合しないことが判明した。以上の結果は、AP-1がCYP11B1特異的な因子であること、さらにAP-1が、副腎皮質の全層に存在する転写因子であるAd4BPの結合を抑制して機能しうることを意味する。従って、Y1細胞に見いだされたAP-1は、CYP11B1遺伝子の副腎皮質内における細胞層特異的発現に関与する因子であることを強く示唆している。

使用源自小鼠肾上腺皮质到上一年的Y1细胞的实验表明，AP-1样的DNA结合蛋白结合了CYP11B1基因的转录起点上游，并且该序列对于启动子活性至关重要。今年，我们进行了分析，目的是确定在Y1细胞的核提取物中发现的AP-1样转录调节蛋白并阐明作用机理，并获得了以下结果。 1。凝胶转移表明，这种DNA结合蛋白与CYP11B1基因的启动子区域结合，但不与B2基因的启动子区域结合，该区域在肾上腺皮质的另一个细胞层中表达。 2。AD4序列结合蛋白（AD4BP）存在于AP-1序列的3'侧，但未观察到蛋白结合。 AD4序列被称为阳性转录调节蛋白，与类固醇合成基因共同。研究了AP-1和AD4序列的转录激活函数。结果，尽管AP-1序列是必不可少的，但在AD4序列中未观察到转录激活能力。 3。已知Y1细胞的核提取物包含AD4BP。因此，当每种蛋白质与AP-1和AD4序列的结合通过使用包含两个位点的启动子序列的探针进行凝胶转移和足迹进行详细检查时，发现AP-1的结合活性至少比AD4BP的结合活性强了五倍，并且两者的结合与每个位置的结合都不是在同一地点结合的。以上结果表明AP-1是CYP11B1特异性因子，并且AP-1可以通过抑制AD4BP的结合来起作用，AD4BP是肾上腺皮质整个层中存在的转录因子。因此，强烈表明在Y1细胞中发现的AP-1是CYP11B1基因肾上腺皮质中细胞层特异性表达的一个因素。

项目成果

向井 邦晃: "ラットのグルココルチコイド合成酵素P45011β遺伝子(CYP11B1)の発現に不可欠なAP-1配列に結合する蛋白質の性質" 生化学. 66. 650-650 (1994)

Kuniaki Mukai：“与大鼠糖皮质激素合酶 P45011β 基因 (CYP11B1) 表达所必需的 AP-1 序列结合的蛋白质的特性”《生物化学》66. 650-650 (1994)。

Mukai,Kuniaki: "Analyses of promoter regions of rat CYP11B genes involved in mineralo-and glucocorticoid syntheses." Cytochrome P450.Biochemistry Biophysics and Molocular Biology. Lechner,E.M.ed.John Libbey Eurotext Ltd.Paris. 659-662 (1994)

Mukai，Kuniaki：“参与矿物质和糖皮质激素合成的大鼠 CYP11B 基因启动子区域的分析。”

向井 邦晃: "AP-1配列によるグルココルチコイド合成酵素遺伝子(CYP11B1)の転写調節機構" 第17回日本分子生物学会年会(1994年12月)年会要旨集. 454-454 (1994)

Kuniaki Mukai：“AP-1序列对糖皮质激素合成酶基因（CYP11B1）的转录调节机制”日本分子生物学会第17届年会摘要（1994年12月）454-454（1994年）。