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樹幹cDNAライブラリーから木質形成の鍵となる遺伝子を得る

从树干 cDNA 文库中获取木材形成的关键基因

基本信息

批准号：
06806021
负责人：
黒田宏之
金额：
$ 1.02万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1994
资助国家：
日本
起止时间：
1994 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-06806021/
关键词：
樹幹 cDNA ゲノムDNA スチルベン合成酵素塩基配列シークエンス PCR プライマー

项目摘要

生物界で形態形成に関与するホメオドメインをもつ遺伝子、樹幹で発現量の高いレクチン遺伝子、心材形成に関与するスチルベン合成酵素遺伝子の3つを、木をかたちづくる遺伝子の候補として手始めに選んだ。ポプラとクロマツの樹幹からmRNAを抽出し、逆転写転写酵素によってcDNAを合成した。このcDNAを鋳型としてPCRによって目的遺伝子を増幅し、塩基配列の決定により確認することにした。(1)ホメオドメイン遺伝子の増幅では、アニーリング温度の低い条件で多数のPCR生成物が確認されたが、特異的な増幅はできなかった。(2)レクチン遺伝子では、PCR生成物は認められなかった。エンジュレクチンの塩基配列をもとにしたプライマーを用いたためと思われる。(3)クロマツからのcDNAでは、予想されるスチルベン合成酵素遺伝子の断片が電気泳動上で確認できた。この塩基配列決定が比較的安価にルーチンで行える方法を検討したが、予想以上にDNA試料を消費してしまった。ここまでの問題点をまとめると、比較的安価に多数の長い塩基配列を決定するためには新たな方法論を確立する必要があり、またDNA量が十分準備されている必要のあることがわかった。そこで、cDNAの代わりにゲノムDNAを出発材料として再度実験を進めることにした。裸子植物・被子植物から合計11樹種のDNAをCTAB法で単離した。対象DNAとしてスチルベン合成酵素遺伝子を選びPCRを行った。PCR条件を詳細に検討し、目的遺伝子断片を特異的に増幅した。これを用いて塩基配列決定条件を検討した。DNAポリメラーゼは、T7系,Taq系を、標識方法は5'標識、内部標識をした。5'蛍光標識したカスタムプライマーを合成すれば、塩基配列が決定できることが証明できた。しかし、多量に長いDNAの塩基配列を決めるためには、逐一塩基配列決定用のカスタムプライマーを購入できない(不経済で時間もかかる)。また、内部標識法は、PCR用プライマーを流用できる反面、長い配列が読めない。今後の課題としてユニバーサルプライマーの付いた配列を効率よく目的DNA断片につなぐなどについて検討する必要がある。

In the biological world, morphogenesis is related to the development of genes, tree trunks, high levels of gene expression, heartwood formation, and synthetic enzyme gene expression. mRNA extraction and cDNA synthesis from the stem of a plant This cDNA sequence was amplified by PCR and confirmed by DNA sequencing. (1)Most of the PCR products were confirmed under low temperature conditions, and the amplitude of the PCR products was increased. (2)The PCR product was identified by PCR. The basic arrangement of the film is to use the film to make the film more beautiful. (3)A fragment of a synthetic enzyme gene is identified by electroporation. This gene alignment determines the safety of the DNA samples compared with the method of analysis. The problem is that most of the DNA sequences are determined by a new methodology. This is the first time that DNA has been produced. The DNA of 11 species of naked plants and angiosperms was isolated by CTAB method. DNA sequencing and PCR analysis PCR conditions are discussed in detail, and the target fragment is amplified in a specific way. This paper discusses the conditions for determining the base allocation. DNA Polarimera na na, T7 series,Taq series na, identification method na 5'identification, internal identification na. 5'Light identification: the combination of light and light, the combination of light and light The gene sequence determination of multiple DNA fragments is based on the gene sequence determination of DNA fragments. , Internal identification method The future problems of DNA fragment detection are discussed in detail.