好熱菌イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素の熱安定性

嗜热异丙基苹果酸脱氢酶的热稳定性

基本信息

批准号：
10157223
负责人：
山岸明彦
金额：
$ 1.09万
依托单位：
Tokyo University of Pharmacy and Life Science
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
1998
资助国家：
日本
起止时间：
1998 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

大腸菌イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素を出発材料として、昨年度337番目の残基が変異している酵素が二つ得られていた。これらのうち、337番目のグリシンがトリプトファンに変換した変異型酵素は熱安定性が上昇していた。この部位はループ中にあり、主鎖の動き易さが減少して耐熱性が上昇している可能性が考えられた。またこの部位のアミノ酸がリジンに変わっている変異型酵素の耐熱性は野生型とほとんど同じであったが、活性が上昇していた。すなわち、同じ部位のアミノ酸残基の変異株が2種類、進化的酵素選択系によって単離されたがその酵素の特性変化は異なっていた。動力学専用コンピュター(MDエンジン)を用いて好熱菌イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素の熱変性過程のシミュレーションを行った。1500Kでの計算を60ps行った。その過程でタンパク質の構造は次第に崩れて変性していく過程が観察された。変性によって、分子の慣性半径は次第に大きくなっていった。この酵素は2つの構造上のドメイン二つからなるサブユニットの二量体である。一つのサブユニットの二つのドメインの重心間距離は変性とともに大きくなったが、二つのサブユニットを結合されるドメイン間の距離は変化しなかった。すなわち、二量体構造を保ったままで二つのドメインが分離する様に変性する過程が観察された。昨年度、好熱菌の耐熱性酵素を出発材料として、常温での酵素活性が上昇した酵素が複数得られた。これらの酵素の活性の特性を詳しく検討した。これらの酵素のうちいくつかの酵素では酵素の触媒定数(kcat)が上昇することによって反応特性が上昇していた。一方他のいくつかの酵素では、ミカエリス定数が低下することによって反応特性が上昇していた。すなわち少なくとも二つの方法によって酵素反応特性を上昇させた酵素が進化的に分離されたことがわかった。

使用大肠杆菌异丙丙酸酯脱氢酶作为起始材料，去年获得了两个残基337突变的酶。其中，将甘氨酸在337转化为色氨酸的突变酶增加了热稳定性。该部分位于循环中，人们认为主链的运动可能会减小，从而增加耐热性。此外，在该部位的氨基酸变为赖氨酸的突变酶的热度与野生型的热量变化，但其活性增加了。也就是说，通过进化酶选择系统分离了同一位点的两个氨基酸残基突变体，但是酶的特性有所不同。动力学特异性计算机（MD发动机）用于模拟嗜热细菌异丙酸酯脱氢酶的热变性过程。在60ps时进行1500K的计算。在此过程中，蛋白质的结构逐渐崩溃并变性。由于变性，分子的惯性半径逐渐增加。该酶是由两个结构结构域组成的亚基的二聚体。一个亚基的两个域中的中心中心中心距离随着变性而增加，但是与两个亚基结合的域之间的距离没有变化。也就是说，观察到在维持二聚体结构的同时分离两个域的过程。去年，使用嗜热细菌作为起始材料获得了几种在室温下酶活性增加的酶。这些酶的活性特性进行了详细研究。随着酶的催化常数（KCAT）增加，这些酶中的一些提高了反应特性。另一方面，由于Michaelis常数降低，其他一些酶具有增加的反应特性。也就是说，发现增加酶反应特性的酶通过至少两种方法进化。