ROCKシグナルを標的とした犬悪性黒色腫の新規治療法の探索

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本研究では、申請者が同定した犬悪性黒色腫の新規治療標的である「PDPN-ROCKシグナル」の阻害による新たな全身療法の確立を目指した前臨床研究を行う。本年度は、PDPNをCRISPR/Cas9法にて欠損させた犬悪性黒色腫細胞株2株(ノックアウト株)および親株のmRNAシークエンスを実施し、PDPN-ROCKシグナルに起因する遺伝子発現変動を検証した。その結果、昨年度のin vitro assayにて明らかになった移動、浸潤、増殖に関連した遺伝子変動を認め、in vitro assayとの結果の一致を確認した。さらに、間葉-アメーバ転換に関連する遺伝子の発現変動を認めた。そこで、PDPN-ROCKシグナルと間葉-アメーバ転換の関連について、in vitro assayにて追加の評価を行なった。その結果、ノックアウト株では細胞形態の球体化指数の低下や細胞質突起の消失などを認め、アメーバ様の形態を示す親株に比べ間葉様の形態へと変化していた。つまり、PDPN-ROCKシグナルは犬悪性黒色腫において間葉-アメーバ転換を促進し、アメーバ様細胞による浸潤転移を促進していることが示唆された。また、ROCK阻害剤のin vitro添加によりノックアウト細胞株で観察された現象を再現できることもわかった。さらに、犬および人の粘膜由来悪性黒色腫症例検体のmRNAシークエンス公共データを用いて、PDPN-ROCKシグナルと間葉-アメーバ転換に関連した遺伝子群の発現変動を解析した。その結果、犬悪性黒色腫症例検体mRNAシークエンスデータにおいても、細胞株を用いた検証と同様に、PDPN-ROCKシグナルによる間葉-アメーバ転換の誘導を示唆するデータが得られた。これらの機序は人の粘膜型悪性黒色腫にも共通して見出された。