エナメル芽細胞極性化におけるp130Casの機能解明

阐明 p130Cas 在成釉细胞极化中的功能

• 批准号: 22K21017
• 负责人: 井上 茜
• 金额: $ 1.83万
• 依托单位: Kyushu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Research Activity Start-up
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-08-31 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22K21017/
• 关键词: 歯; エナメル芽細胞; 分化; 細胞極性

エナメル芽細胞はその分化過程において、ダイナミックにその形態を変えながら様々な機能を発揮する細胞であり、それぞれの形態に特有の機能を有するユニークな細胞であると言える。これまでの研究で、細胞接着、細胞骨格の維持および細胞極性などの細胞プロセスに関与することで知られるp130Casに着目し、破骨細胞の骨吸収メカニズムに必須である波状縁の形成に重要であることを発見した。本因子はエナメル芽細胞分化にも影響を与え、細胞極性に重要であることが考えられる。そこで本研究では、p130casを介したエナメル芽細胞分化メカニズムを解析することで、細胞極性による新たな細胞分化制御機構の解明を目的として研究を開始した。本年度は主に、CRIPR/Cas9システムを用いて、p130Cas遺伝子欠損細胞株の樹立を行った。これまでに樹立した、歯原性上皮幹細胞株M3H1を用いて、p130cas遺伝子のexon 2 が欠失したp130遺伝子欠損細胞株を作製した。具体的には、exon 2の両端を特異的に認識する gRNAを作製し、 Cas9タンパク質とともに electroporation 法にて導入を行った。その際、同時にGFP発現ベクターを一過性に遺伝子導入することで、遺伝子導入が成功した細胞の可視化を行った。GFP+ 細胞を、フローサイトメーターを用いて回収し、96well プレートを用いてシングルセル単離培養を行った。シングルセル単離培養にて、クローンの作製に成功した細胞を用いて、western blotting法および免疫染色法を用いてタンパクレベルで p130Casの発現を確認した。p130Cas の発現の消失を認めたクローンをp130 Cas 遺伝子欠損細胞株と定義した。次年度は、本細胞株を用いた機能解析を行う。

The differentiation process of the cell in vitro is characterized by morphological changes and functional changes. This research is related to cell adhesion, cell skeleton maintenance, and cell polarity. It is known that p130Cas are important for bone resorption, and osteoclast bone resorption is essential for the formation of undulations. This factor affects cell differentiation and cell polarity. This study is aimed at elucidating the mechanism of cell differentiation control by p130cas. This year, the main CRIPR/Cas9 gene system was used, and the p130Cas gene deficient cell line was established. The primary epithelial stem cell line M3H1 was established using exon2 and p130 case-deficient cell lines. Specific exon2 terminal recognition gRNA control, Cas9 terminal quality and electroporation method At the same time, GFP was detected, and the gene was introduced transiently. GFP+ cells were cultured in 96-well medium. The successful production of p130Cas in cell culture was confirmed by Western blotting and immunostaining. The disappearance of the discovery of p130Cas has been recognized and the definition of the p130 Cas gene-deficient cell line has been developed. The next year, this cell line is used for functional analysis.