プロテオーム解析を用いた新規エナメル芽細胞分化誘導因子の検索

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エナメル芽細胞の新規分化誘導因子を検索するため、まず初めに、レーザーマイクロダイセクション(LMD)を用いて組織切片上のエナメル芽細胞を正確に採取する条件の検討を行った。最終的にはヒトの埋伏智歯を材料として用いる予定であるが、サンプルの確保が困難であるため、予備実験としてSDラット(生後1日齢)の下顎切歯を用いた。採取した下顎骨をOCTコンパウンドに包埋し、ドライアイスエタノールで凍結し、未固定非脱灰凍結切片を作成した。なお、染色には、後に行う液体クロマトグラフィータンデム質量分析(LC-MS/MS)への影響が少ないヘマトキシリンのみを用いた。種々の厚みの切片やレーザー強度を試した結果、エナメル芽細胞の採取を行うための最適なLMDの条件を見出した。続いて、LC-MS/MS解析の予備実験として、大量の採取が容易な歯原性上皮細胞全体をサンプルに用いて、切片作成時やLMD時のケラチンの混入の有無、必要とする蛋白質の量、蛋白質の検出感度について検討を行った。5μgの蛋白質を用いてLC-MS/MSを行った結果、ケラチンの混入がわずかに認められたが、101個の蛋白質が検出され、その中にはこれまでに報告されているエナメル芽細胞の分化マーカーも含まれていた。ただし、転写因子などの細胞内での発現量が少ないと思われる蛋白質については十分に検出できなかったことから、蛋白質の量や分画数を増やす等のさらなる条件検討を行ってから、エナメル芽細胞の新規分化誘導因子を検索する必要がある。