温度勾配蒸気拡散法による膜蛋白質の結晶化技術の開発

温度梯度气相扩散法膜蛋白结晶技术的开发

• 批准号: 03454567
• 负责人: 神山 勉
• 金额: $ 3.2万
• 依托单位: The Institute of Physical and Chemical Research
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (B)
• 财政年份: 1991
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1991 至 1992
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-03454567/
• 关键词: 蛋白質の結晶化; 膜蛋白質; 生体膜; バクテリオロドプシン; 蛋白質結晶構造解析; 起高次構造; X線構造解析; 光合成反応中心; 温度勾配蒸気拡散法; X線結晶構造解析; バクテリオロドプシ; 光合成光化学系II; 膜蛋白質の結晶化; 界面活性剤

温度勾配蒸気拡散法という新しい結晶化法の開発を行ってきたが、この研究の途上で、バクテリオロドプシンの結晶(六方晶)が大きく(〜1mm)成長する結晶化条件を見いだした。この六方晶のX線結晶構造解析を行なうため、小角領域の回析像(振動写真)を高分解能で記録できるようにX線カメラの改良を行ない、また、結晶構造を維持する方法についてもいろいろな角度から検討した。結晶内の蛋白質占有率が低いとか、長周期構造が存在するとか、のX線構造解析を難しくしている要因が明らかとなったが、これらの諸問題を克服して、最終的に結晶の格子定数(空間群R32もしくはP6_322,ah=53mm)求めた。さらに、結晶内の蛋白質のパッキングの情報を独立に得る方法について検討し、具体的には、結晶の破片を電子顕微鏡を用いて観察し、結晶表面の構造を原子間力顕微鏡を用いて観察した。その結果、「バクテリオロドプシン数百分子が集合して径50mmの球殻構造を形成し、これが最密充填して結晶を構成する。ということを明らかにした。また、結晶の破片の懸濁液の光誘起PH変化の測定を行ない、球殻構造体には脂質が含まれること、バクテリオロドプシンのプロトンポンプ活性が正常であること、蛋白質のC末端側(細胞質側表面)が外側を向いていること、を明らかにした。膜蛋白質の3次元結晶を大きくかつ定速に成長させる技術の確立を目指して、蛋白質の結晶化法として利用されている温度勾配法を蒸気拡散法の利点を取り入れ、両者をドッキングした技法の開発を行なうことが本研究課題の主目標であった。しかし、上述した様に研究が予定していたより急速に進展してしまい、新しい結晶化技術を確立するための基礎研究に充分な時間を費やすことができなかった。この点に関しては反省し、今後の研究課題として引き続き研究を行なっていくつもりである。

Temperature hook with steamed 気 company, scattered method と い う new し い crystallization method の open 発 を line っ て き た が, こ の research on で の way, バ ク テ リ オ ロ ド プ シ ン の crystallization (hexagonal) が き く (~ 1 mm) growth す る crystallization conditions を see い だ し た. こ の hexagonal の X-ray crystal structure line を な う た め, small Angle domain の back like photo (vibration) を record high decomposition can で で き る よ う に X-ray カ メ ラ の improved line を な い, ま た, crystallization structure を maintain す る method に つ い て も い ろ い ろ な Angle か ら beg し 検 た. Low protein crystallization in の share が い と か, long cycle structure exist が す る と か, の X-ray structure parsing を difficult し く し て い る by が Ming ら か と な っ た が, こ れ ら を の these issues to overcome し て, final に crystallization の lattice constant (space group R32 も し く は P6_322, ah = 53 mm) for め た. さ ら に, crystallization の protein の パ ッ キ ン グ の intelligence を independent に method る に つ い て beg し 検, concrete に は, crystallization を の fragment electronic 顕 micromirror を with い て 観 の し, crystal surface structure を interatomic force 顕 micromirror を with い て 観 examine し た. そ の results, "バ ク テ リ オ ロ ド プ シ ン hundreds of molecular が collection し て diameter of 50 mm の を spherical shell structure forming し, こ れ が closest filling し て crystallization を constitute す る. と い う こ と を Ming ら か に し た. ま た, crystallization の fragment の suspension の light induced PH variations change の determination を line な い, spherical shell structure body に は lipid が containing ま れ る こ と, バ ク テ リ オ ロ ド プ シ ン の プ ロ ト ン ポ ン プ activity が normal で あ る こ の と, protein C terminal side (cytoplasmic side surface) to い が lateral を て い る こ と, を Ming ら か に し た. Membrane protein crystallization の 3 dimensional を big き く か つ constant speed に growth さ せ る technology の establish を refers し て, protein の crystallization method と し て using さ れ て い る temperature hook with steaming method を 気 company, scattered method の tartness を take り れ, struck を ド ッ キ ン グ し た techniques の open 発 を line な う こ と が の main goal of this study subject で あ っ た. し か し, the above し た others に research が designated し て い た よ り に progress rapidly し て し ま い, new し い を crystallization technology to establish す る た め の basic research に fully な time を や す こ と が で き な か っ た. こ の point に masato し て は reflection し, の research topics in the future と し て lead き 続 き を line な っ て い く つ も り で あ る.

项目成果

J.Shen,Y.Inoue: "Low ph-induced Dissociation of Three Extrinsic Proteins from O_2-Evoluing PhotosystemII" Plant cell Physiol. 32. 453-457 (1991)

J.Shen，Y.Inoue：“低 ph 诱导的 O_2 进化光系统 II 中三种外来蛋白的解离”植物细胞生理学。

S.Sakurai,I.Sakurai,Y.Kawamura&T.Nakaya: "Electron diffraction study on two-dimensional domain structure of L-DPPC monolayer." Biochimica et Biophysica Acta.

樱井S、樱井一、河村Y

I.Sakurai,Y.Kawamura,T.Suetsugu&T.Nakaya: "Structure of the condenced phase of methacrylic copolymers with lipidic side chains." Macromolecules. 25. 7256-7260 (1992)

樱井一、河村Y、末次T

J.-R.Shen,M.Ikeuchi&Y.Inoue: "Stoichiometric association of extrinsic cytochrome C550 and 12 kDa protein with a hiqhly purified oxyqen-evolving photosvstem II core complex from Synechococcus valcanus" FEBS Lett.301. 145- (1992)

J.-R.沉,M.池内

K.Fukuda&T.Kouyama: "Formation and decay kinetics of bacteriorhodopsin's Nintermediate:Softening the protein conformation with alcohols affects intra-protein proton transfer and retinal isomerezation." Photochem.Photbiol.56. 1057-1062 (1992)

福田康夫