Development of the reconstituted folding/translation-coupled system to analyze relevant diseases

ヒト因子由来再構成型翻訳システムに、ヒト細胞質主要シャペロンタンパク質（シャペロニンCCT, 新生鎖結合シャペロンNAC, リボソーム結合シャペロンRAC, Hsp70s, Hsp90s, プレフォルディン）を添加することにより再構成型翻訳・細胞質フォールディング連動システムシステム（細胞質タンパク用）を樹立した。次に再構成型翻訳・SRP連結システムの開発を進めた。まずSRPの再構成に取り組んだ。SRPは302ntのRNA (7SL RNA)とSRP9, SRP14, SRP19, SRP54, SRP68, SRP72といった６種類のタンパク質から成る。7SL RNA はin vitroの転写によって得た。SRP9, SRP14, SRP19, SRP54, SRP68, SRP72をHeLa細胞抽出液再構成系及び再構成系で発現するシステムを整えた。また、これらをT7 RNPワクシニアウイルスシステム（BHK細胞）で同時発現するシステムを構築した。次にSRPリセプター（SRa, SRb）及びSec61トランスロコン（Sec61a, Sec61b, Sec61g）を発現するシステムをHeLa細胞抽出液再構成系、再構成系そしてT7 RNPワクシニアウイルスシステム（BHK細胞）にて構築した。これらは複合体であるため、共発現、または単独発現＋混合　という二つの戦略に関しての条件検討を行った。目下のところSRP, SR, Sec61いずれもHeLa細胞抽出液再構成系で発現し、FLAGカラムを利用して複合体を精製するという方法が最も効率が良いことがわかった。次年度はこのシステムを利用して、リコンビナントSRP, SRa/SRb/Sec61a/b/g　を精製し、再構成系とliposome上で「再構成型翻訳・SRP連結システム」を構築していく。

ヒト因子由来再構成型翻訳システムに、ヒト細胞質主要シャペロンタンパク質（シャペロニンCCT, 新生鎖結合シャペロンNAC, リボソーム結合シャペロンRAC, Hsp70s, Hsp90s, プレフォルディン）を添加することにより再構成型翻訳・細胞質フォールディング連動システムシステム（細胞質タンパク用）を樹立した。次に再構成型翻訳・SRP連結システムの開発を進めた。まずSRPの再構成に取り組んだ。SRPは302ntのRNA (7SL RNA)とSRP9, SRP14, SRP19, SRP54, SRP68, SRP72といった６種類のタンパク質から成る。7SL RNA はin vitroの転写によって得た。SRP9, SRP14, SRP19, SRP54, SRP68, SRP72をHeLa細胞抽出液再構成系及び再構成系で発現するシステムを整えた。また、これらをT7 RNPワクシニアウイルスシステム（BHK細胞）で同時発現するシステムを構築した。次にSRPリセプター（SRa, SRb）及びSec61トランスロコン（Sec61a, Sec61b, Sec61g）を発現するシステムをHeLa細胞抽出液再構成系、再構成系そしてT7 RNPワクシニアウイルスシステム（BHK細胞）にて構築した。これらは複合体であるため、共発現、または単独発現＋混合　という二つの戦略に関しての条件検討を行った。目下のところSRP, SR, Sec61いずれもHeLa細胞抽出液再構成系で発現し、FLAGカラムを利用して複合体を精製するという方法が最も効率が良いことがわかった。次年度はこのシステムを利用して、リコンビナントSRP, SRa/SRb/Sec61a/b/g　を精製し、再構成系とliposome上で「再構成型翻訳・SRP連結システム」を構築していく。