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Development of the reconstituted folding/translation-coupled system to analyze relevant diseases

开发重建折叠/平移耦合系统来分析相关疾病

基本信息

批准号：
22H02612
负责人：
今高寛晃
金额：
$ 11.15万
依托单位：
University of Hyogo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2026-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

ヒト因子由来再構成型翻訳システムに、ヒト細胞質主要シャペロンタンパク質（シャペロニンCCT, 新生鎖結合シャペロンNAC, リボソーム結合シャペロンRAC, Hsp70s, Hsp90s, プレフォルディン）を添加することにより再構成型翻訳・細胞質フォールディング連動システムシステム（細胞質タンパク用）を樹立した。次に再構成型翻訳・SRP連結システムの開発を進めた。まずSRPの再構成に取り組んだ。SRPは302ntのRNA (7SL RNA)とSRP9, SRP14, SRP19, SRP54, SRP68, SRP72といった６種類のタンパク質から成る。7SL RNA はin vitroの転写によって得た。SRP9, SRP14, SRP19, SRP54, SRP68, SRP72をHeLa細胞抽出液再構成系及び再構成系で発現するシステムを整えた。また、これらをT7 RNPワクシニアウイルスシステム（BHK細胞）で同時発現するシステムを構築した。次にSRPリセプター（SRa, SRb）及びSec61トランスロコン（Sec61a, Sec61b, Sec61g）を発現するシステムをHeLa細胞抽出液再構成系、再構成系そしてT7 RNPワクシニアウイルスシステム（BHK細胞）にて構築した。これらは複合体であるため、共発現、または単独発現＋混合　という二つの戦略に関しての条件検討を行った。目下のところSRP, SR, Sec61いずれもHeLa細胞抽出液再構成系で発現し、FLAGカラムを利用して複合体を精製するという方法が最も効率が良いことがわかった。次年度はこのシステムを利用して、リコンビナントSRP, SRa/SRb/Sec61a/b/g　を精製し、再構成系とliposome上で「再構成型翻訳・SRP連結システム」を構築していく。

The factor is derived from the reconstitution-type transformation process, and the cytoplasmic main selection process is established by adding the reconstitution-type transformation process to the cytoplasmic main selection process (selection process CCT, new lock combination selection process NAC, selection process RAC, Hsp70s, Hsp90s, selection process). The development of the secondary reconstruction model SRP link system SRP is reorganized into groups. SRP302nt RNA (7SL RNA) and SRP9, SRP14, SRP19, SRP54, SRP68, SRP72 are six kinds of RNA. 7SL RNA was found in vitro. SRP9, SRP14, SRP19, SRP54, SRP68, SRP72, HeLa extract reconstitution lines and reconstitution lines were developed. T7 RNP cells are constructed to simultaneously generate a system. Next, SRP (SRa, SRb) and Sec61 (Sec 61a, Sec 61b, Sec 61g) were developed. HeLa cell extract reconstitution system and reconstitution system were constructed. The complex is composed of two parts: one part is complex, the other part is complex, and the other part is complex. At present, SRP, SR, Sec61 contains HeLa cell extract reconstitution system, FLAG complex utilization and purification method, which has the best efficiency. In the next year, we will refine SRa/SRb/Sec61a/b/g and construct a reconfiguration system on the "reconfiguration model SRP link system".