インテグリンによる細胞相互作用の可塑性と堅牢性の生成メカニズムと生体機能の解明

（１）インテグリンを調節する分子間の細胞内結合動態と接着誘導の解明：細胞外LFA1と細胞内α4β1, α4β7, αIIbβ3 のキメラ分子を作成・BAF細胞に導入後、結合過程の一分子イメージングによる結合動態解析を行った。高親和性細胞外LFA1をmAb24で誘導し細胞内領域（CT）をβ2からβ1,β7に置換したキメラ分子とtalin1との結合はβ7がもっとも弱く、β2がもっとも強いことが明らかになった。（２）ローリング、一過性停止(tether)、安定した停止(arrest)の動態変化をする実験系を用いて、遺伝子欠損T細胞の解析からtalin1、kindlin3、Rap1a/Rap1b、Rap1活性化因子 (RasGRP2, C3G)がCCL21による停止に必須であった。Rap1 affinity probe, halotag-talin1 knock-inマウス由来T細胞を用い、潅流下のキャプチャーからRap1が活性化し、遺伝子欠損T細胞の解析から, ローリングの安定化（速度低下）にはRap1、talin1が必要であるが、kindlin-3は必要ないこと、停止接着にはRap1, talin1, kindlin-3が必要であることが明らかになった。（３）細胞極性および細胞接着・移動の制御過程を明らかにする。前年度の解析結果から接着非依存性のCCL21によるT細胞の細胞極性をimaging cytometryおよびAIによる数万の画像解析の自動化によってRap1依存性を同定した。さらにRap1はDOCK2/Racによるアクチン骨格の成長(pseudopod)に依存してC3G/RasGRP2が活性しRap1の活性化を誘導することが明らかになった。

（１）インテグリンを調節する分子間の細胞内結合動態と接着誘導の解明：細胞外LFA1と細胞内α4β1, α4β7, αIIbβ3 のキメラ分子を作成・BAF細胞に導入後、結合過程の一分子イメージングによる結合動態解析を行った。高親和性細胞外LFA1をmAb24で誘導し細胞内領域（CT）をβ2からβ1,β7に置換したキメラ分子とtalin1との結合はβ7がもっとも弱く、β2がもっとも強いことが明らかになった。（２）ローリング、一過性停止(tether)、安定した停止(arrest)の動態変化をする実験系を用いて、遺伝子欠損T細胞の解析からtalin1、kindlin3、Rap1a/Rap1b、Rap1活性化因子 (RasGRP2, C3G)がCCL21による停止に必須であった。Rap1 affinity probe, halotag-talin1 knock-inマウス由来T細胞を用い、潅流下のキャプチャーからRap1が活性化し、遺伝子欠損T細胞の解析から, ローリングの安定化（速度低下）にはRap1、talin1が必要であるが、kindlin-3は必要ないこと、停止接着にはRap1, talin1, kindlin-3が必要であることが明らかになった。（３）細胞極性および細胞接着・移動の制御過程を明らかにする。前年度の解析結果から接着非依存性のCCL21によるT細胞の細胞極性をimaging cytometryおよびAIによる数万の画像解析の自動化によってRap1依存性を同定した。さらにRap1はDOCK2/Racによるアクチン骨格の成長(pseudopod)に依存してC3G/RasGRP2が活性しRap1の活性化を誘導することが明らかになった。