RAPLによるリンパ球極性誘導機構を解明するシステムの樹立

低分子量Gタンパク質Rap1とそのエフェクター分子RAPLはTCRやケモカインによるLFA-1、VLA-4の接着性亢進を伝達するinside-outシグナルである。Rap1-RAPLにインテグリン接着上昇の機序は細胞極性誘導と連関してインテグリンを細胞先端極に集積させることによることを明らかにしてきた。この機序をさらに明らかにするために可視化技術を用いて解析する系を樹立することを試みた。樹状細胞は特徴的な樹状突起や大きな細胞質もち、可視化技術による観察に適しており、しかもリンパ球と同様、Rap1-RAPLによる高い動態能力を持つ細胞である。そこでまず樹状細胞を用いてRap1-RAPLの細胞内局在変化をとらえる系を樹立した。Rap1の活性化型であるRap-1GTPに特異的に結合するRalGDS由来のRap1-binding domainにGFPを融合させたGFP-RalGDS-RBD蛋白質を作成した。またGFPに融合させたRAPLを作成した。また細胞極性誘導におけるRap1の必要性を調べるため、Rap1を特異的に不活化するSpa1や優性活性化型Rap1V12をレトロウイルスで導入する系を作製した。これらを骨髄由来樹状細胞に導入し、ケモカインCCL21刺激による細胞極性形成はRap1-RAPLに依存して一極にラッフル膜を形成し、そこにRap1-GTPやRAPLが移行する。またLFA-1,VLA-4も同じ部位に集積した。現在、微小管、アクチン線維、小胞マーカーを用いてこれらとの関係を解析している。

低分子量Gタンパク質Rap1とそのエフェクター分子RAPLはTCRやケモカインによるLFA-1、VLA-4の接着性亢進を伝達するinside-outシグナルである。Rap1-RAPLにインテグリン接着上昇の機序は細胞極性誘導と連関してインテグリンを細胞先端極に集積させることによることを明らかにしてきた。この機序をさらに明らかにするために可視化技術を用いて解析する系を樹立することを試みた。樹状細胞は特徴的な樹状突起や大きな細胞質もち、可視化技術による観察に適しており、しかもリンパ球と同様、Rap1-RAPLによる高い動態能力を持つ細胞である。そこでまず樹状細胞を用いてRap1-RAPLの細胞内局在変化をとらえる系を樹立した。Rap1の活性化型であるRap-1GTPに特異的に結合するRalGDS由来のRap1-binding domainにGFPを融合させたGFP-RalGDS-RBD蛋白質を作成した。またGFPに融合させたRAPLを作成した。また細胞極性誘導におけるRap1の必要性を調べるため、Rap1を特異的に不活化するSpa1や優性活性化型Rap1V12をレトロウイルスで導入する系を作製した。これらを骨髄由来樹状細胞に導入し、ケモカインCCL21刺激による細胞極性形成はRap1-RAPLに依存して一極にラッフル膜を形成し、そこにRap1-GTPやRAPLが移行する。またLFA-1,VLA-4も同じ部位に集積した。現在、微小管、アクチン線維、小胞マーカーを用いてこれらとの関係を解析している。