The study using chemical genetics to reveal regulation mechanisms of insulocortical hyperactivities in the neuropathic pain model

令和4年度は，アデノ随伴ウイルスベクターを用いて，島皮質の主要な抑制性ニューロンであるparvalbumin陽性ニューロンに対して特異的にムスカリン3型デザイナー受容体を発現させることに取り組んだ。福島医科大学の小林和人教授から供与されたLE-Tg(Pvalb-cre)2Kobaラットの島皮質にAAV-Flox-hM3D-mCherryを注入し，免疫組織化学的にparvalbumin陽性ニューロン特異的にAAVが感染しているか検証した。当初，AAV5-Flox-hM3D-mCherry（AAV-hM3D）を用いて実験を行った結果，parvalbumin陽性ニューロンのみならず，錐体ニューロンと考えられる細胞にも感染していることが明らかとなった。そこでAAVのセロタイプを変更して検証した結果，AAV2が感染効率および感染特異性も高い最適なセロタイプであることが明らかとなった。この結果に基づき，以降の実験について，ベクターにはAAV2-Flox-hM3D-mCherry（AAV2-hM3D）を用いることとした。次に，AAV-hM3D注入後3週後に島皮質スライス標本を作製し，mCherryで標識された細胞からホールセル・パッチクランプ記録を行った。その結果，mCherry陽性ニューロンは，脱分極通電によって活動電位の持続時間が極めて短く，50-100 Hz以上の高頻度の連続発火を示した。したがって，mCherry陽性ニューロンは，いわゆるfast-spikingニューロンであると考えられた。したがって，電気生理学的にも，LE-Tg(Pvalb-cre)2KobaラットにAAV2-hM3Dを注入することによって，parvalbumin陽性ニューロン特異的にヒトムスカリン3型デザイナー受容体を発現させることが可能であることを明らかに出来た。

令和4年度は，アデノ随伴ウイルスベクターを用いて，島皮質の主要な抑制性ニューロンであるparvalbumin陽性ニューロンに対して特異的にムスカリン3型デザイナー受容体を発現させることに取り組んだ。福島医科大学の小林和人教授から供与されたLE-Tg(Pvalb-cre)2Kobaラットの島皮質にAAV-Flox-hM3D-mCherryを注入し，免疫組織化学的にparvalbumin陽性ニューロン特異的にAAVが感染しているか検証した。当初，AAV5-Flox-hM3D-mCherry（AAV-hM3D）を用いて実験を行った結果，parvalbumin陽性ニューロンのみならず，錐体ニューロンと考えられる細胞にも感染していることが明らかとなった。そこでAAVのセロタイプを変更して検証した結果，AAV2が感染効率および感染特異性も高い最適なセロタイプであることが明らかとなった。この結果に基づき，以降の実験について，ベクターにはAAV2-Flox-hM3D-mCherry（AAV2-hM3D）を用いることとした。次に，AAV-hM3D注入後3週後に島皮質スライス標本を作製し，mCherryで標識された細胞からホールセル・パッチクランプ記録を行った。その結果，mCherry陽性ニューロンは，脱分極通電によって活動電位の持続時間が極めて短く，50-100 Hz以上の高頻度の連続発火を示した。したがって，mCherry陽性ニューロンは，いわゆるfast-spikingニューロンであると考えられた。したがって，電気生理学的にも，LE-Tg(Pvalb-cre)2KobaラットにAAV2-hM3Dを注入することによって，parvalbumin陽性ニューロン特異的にヒトムスカリン3型デザイナー受容体を発現させることが可能であることを明らかに出来た。