血管内皮・平滑筋細胞の相互作用による潜在型TGFーβ活性化の機序解明

本研究は内皮細胞と平滑筋細胞の混合培養系を用いて潜在型TGFーβ(LTGFーβ)の活性化におけるTGFーβ越合蛋白質(LAP:latency associated protein及びLTBP:latent TGF‐β binding protein)の役割を明かにすることを目標とした。LTGF‐βの活性化の判定は以前報告した方法に準じて、平滑筋細胞による内皮細胞遊走阻害作用を指標にした。まずLTGFーβからTGFーβを除去し得られたLAPとLTBPとのcomplexに対するpolyclonal抗体(抗MP抗体)を作成し、平滑筋細胞の内皮細胞遊走阻害に対する効果を検討したところ、抗MP抗体は遊走阻害効果を中和することが確認された。そこで次にLAPとLTBPのcomplexに対するmonoclonal抗体を作成した。得られた10個のclone(KM698〜KM707)について今回購入したマイクロプレ-トリ-ダ-を用いて解析した結果、KM698、702、704、707はLAP部分を、またKM699、700、701、703、705、706はLTBP部分を認識することが明かとなっている。そこでこれらのmonoclonal抗体について平滑筋細胞の内皮細胞遊走阻害に対する効果を検討したところKM704のみで遊走阻害効果が中和されることが判明した。次にKM704がLTGFーβの活性化を阻害する機序について検討したところ以下の事が明かとなった。平滑筋細胞の細胞表面にはLTGFーβに対する選択的結合部位が存在しており、KM704はこのLTGFーβの細胞表面への結合を阻害する。LTGFーβの活性化は内皮細胞表面で蛋白分解酵素によって成されるが内皮細胞の表面にはLTGFーβに対する選択的結合部位が無いため内皮細胞単独ではLTGFーβは活性化されず、このため混合培養において平滑筋細胞表面へのLTGF‐βの結合が必須であり、KM704はこのプロセスを阻害することによりLTGFーβの活性化を阻害する。今後はLAP分子中のKM704の認識部位と共にLTGFーβ選択的結合部位の同定が課題である。

本研究は内皮細胞と平滑筋細胞の混合培養系を用いて潜在型TGFーβ(LTGFーβ)の活性化におけるTGFーβ越合蛋白質(LAP:latency associated protein及びLTBP:latent TGF‐β binding protein)の役割を明かにすることを目標とした。LTGF‐βの活性化の判定は以前報告した方法に準じて、平滑筋細胞による内皮細胞遊走阻害作用を指標にした。まずLTGFーβからTGFーβを除去し得られたLAPとLTBPとのcomplexに対するpolyclonal抗体(抗MP抗体)を作成し、平滑筋細胞の内皮細胞遊走阻害に対する効果を検討したところ、抗MP抗体は遊走阻害効果を中和することが確認された。そこで次にLAPとLTBPのcomplexに対するmonoclonal抗体を作成した。得られた10個のclone(KM698〜KM707)について今回購入したマイクロプレ-トリ-ダ-を用いて解析した結果、KM698、702、704、707はLAP部分を、またKM699、700、701、703、705、706はLTBP部分を認識することが明かとなっている。そこでこれらのmonoclonal抗体について平滑筋細胞の内皮細胞遊走阻害に対する効果を検討したところKM704のみで遊走阻害効果が中和されることが判明した。次にKM704がLTGFーβの活性化を阻害する機序について検討したところ以下の事が明かとなった。平滑筋細胞の細胞表面にはLTGFーβに対する選択的結合部位が存在しており、KM704はこのLTGFーβの細胞表面への結合を阻害する。LTGFーβの活性化は内皮細胞表面で蛋白分解酵素によって成されるが内皮細胞の表面にはLTGFーβに対する選択的結合部位が無いため内皮細胞単独ではLTGFーβは活性化されず、このため混合培養において平滑筋細胞表面へのLTGF‐βの結合が必須であり、KM704はこのプロセスを阻害することによりLTGFーβの活性化を阻害する。今後はLAP分子中のKM704の認識部位と共にLTGFーβ選択的結合部位の同定が課題である。