複製と転写の制御蛋白DnaAの機能構造の解析と結晶化

复制转录控制蛋白DnaA功能结构分析与结晶

• 批准号: 03259209
• 负责人: 小笠原 直毅
• 金额: $ 1.41万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1991
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1991 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-03259209/
• 关键词: 枯草菌; DnaA蛋白; DNA結合ドメイン; ATP結合ドメイン

1.DnaA蛋白は真正細菌で普遍的に染色体の複製及び遺伝子の発現を制御する重要な蛋白である。我々は、5細菌のDnaA蛋白のアミノ酸配列を比較することにより、Nー末端約60アミノ酸からなる中程度に配列が保存されているドメインI,続く、細菌毎に長さが異なり(40ー100アミノ酸)、配列に保存性が認められないドメインII、約230アミノ酸からなり、ATP結合配列を含む配列が高度に保存されているドメインIII、Cー末端約100アミノ酸からなり、機能未知の配列が保存されているドメインIVの4ドメインからDnaA蛋白が構成されていると推定した。2.そこで、枯草菌DnaA蛋白のドメイン構造を生化学的に同定するために特異的なプロテア-ゼ感受性部位の有無を解析した。3種のプロテア-ゼ(Trypsin、V8protease、Endoprotease AspーN)を用いて精製した枯草菌DnaA蛋白の部分分解を試みたところ、40kdおよび32kdの部分分解産物が共通して得られ、そのNー末端のアミノ酸配列から、枯草菌DnaA蛋白には2箇所の、Nー末端から約100アミノ酸の位置とCー末端から約100アミノ酸の位置、特異的なプロテア-ゼ感受性部位があることが明らかになった。その位置は配列から予測したドメインIIとIII、ドメインIIIとIVの境界とよく一致しており、各ドメインを結ぶhinge領域と推定される。3.さらに、ドメインIVがDNA結合ドメインではないかと推定し、その証明を試みた。限定分解産物を精製することが困難であったため、部分分解産物をnative DNA celluloseカラムによりDNA結合能を保持している産物と失った産物を分画したところ、ドメインIVがDNA結合に必須であることが明らかとなった。さらに、ドメインIVとマルト-ス結合蛋白とのハイブリッド蛋白を部分精製し、ゲルシフト実験を行ったところ、ドメインIVのみで特異的なDNA結合能があることが証明された。

1. DnaA protein is an important protein for controlling chromosome replication and gene development in real bacteria. The DNA sequence of DnaA protein in 5 bacteria was compared. The DNA sequence of DnaA protein in 5 bacteria was about 60 amino acids at the N-terminal. The DNA sequence of DnaA protein in 5 bacteria was different from that of DnaA protein in 5 bacteria.(40 - 100 ° C acid), alignment preservation, ATP binding alignment, high degree of alignment preservation, ATP III, C-terminal about 100 ° C acid, function unknown, alignment preservation, DnaA protein composition, and presumptive. 2. Analysis of the structure and biochemical identity of DnaA protein in Bacillus subtilis 3 kinds of (Trypsin, V8protease, Endoproteinase Asp-N) was used to purify the partial decomposition products of DnaA protein from Bacillus subtilis. The partial decomposition products of DnaA protein from 40kd to 32kd were common. The N-terminal acid sequence of DnaA protein from Bacillus subtilis was 2 sites, the N-terminal acid sequence was about 100 sites, and the C-terminal acid sequence was about 100 sites. Special sensitive parts are not available. The positions of the two groups are arranged in the following ways: prediction, III, III, IV, convergence, hinge, estimation, etc. 3. The DNA binding test was performed on the DNA binding test. To limit the decomposition products, we must refine the products according to their DNA binding properties. The DNA binding ability of the protein was demonstrated by the partial purification of the protein.

项目成果

Ogasawara,N.: "Initiation of chromosome replication:structure and function of oriC and DnaA protein in eubacteria" Res.Microbiol.142. 851-859 (1991)

Ogasawara, N.：“染色体复制的起始：真细菌中 oriC 和 DnaA 蛋白的结构和功能”Res.Microbiol.142。

Yoshikawa,H.: "Structure and function of DnaA and DnaAーbox in eubacteria:evolutionary relationship of bacterial replication origins" Mol.Microbiol.5. 2589-2597 (1991)

Yoshikawa, H.：“真细菌中 DnaA 和 DnaA-box 的结构和功能：细菌复制起源的进化关系”Mol.Microbiol.5 (1991)。

Fujita,M.Q.: "Structure of the dnaA and DnaAーbox region in the Mycoplasma capricolum chromosome:conservation and variations in the course of evolution" Gene. 110. 17-23 (1992)

Fujita, M.Q.：“山羊支原体染色体中 dnaA 和 DnaA-box 区域的结构：进化过程中的保守性和变异”Gene。 110. 17-23 (1992)