複製と転写の制御蛋白DnaAの機能構造の解析と結晶化

复制转录控制蛋白DnaA功能结构分析与结晶

• 批准号: 04254210
• 负责人: 小笠原 直毅
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1992
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1992 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-04254210/
• 关键词: 枯草菌; 染色体複製; DnaA蛋白; DNA結合ドメイン; ATP結合ドメイン

1.DnaA蛋白は真正細菌で普遍的に染色体の複製及び遺伝子の発現を制御する。我々は、5細菌のDnaA蛋白のアミノ酸配列を比較することにより、N-末端的60アミノ酸からなる中程度に配列が保存されているドメインI、続く、細菌毎に長さが異なり(40-100アミノ酸)、配列に保存性が認められないドメインII、的230アミノ酸からなり、ATP結合配列を含む配列が高度に保存されているドメインIII、C-末端的100アミノ酸からなり、機能未知の配列が保存されているドメインIVの4ドメインからDnaA蛋白が構成されていると推定した。2.そこで、3種のプロテアーゼを用いて精製した枯草菌DnaA蛋白の部分分解を試みたところ、40kdおよび32kdの部分分解産物が共通して得られ、そのN-末端のアミノ酸配列から、ドメインIIとIII、ドメインIIIとIVの境界の2箇所に、特異的なプロゼアーゼが感受性部位があることが明らかになった。3.部分分解産物をnativeDNAcelluloseカラムによりDNA結合能を保持している産物と失った産物を分画したところ、ドメインIVを含む産物のみが結合し、それがDNA結合に必須であることが明らかとなった。そこで、ドメインIVとマルトース結合蛋白とのハイブリット蛋白を部合精製し、ゲルシフト実験を行ったところ、DnaA-boxを含む断片にのみ結合し、確かにドメインIVのみで特異的なDNA結合能があることが証明された。4.枯草菌DnaA蛋白のドメインIVを単独に精製しその機能を生化学的に解析することを目指したが、予想に反してマルートース結合蛋白とのハイブリッド蛋白がマルトースカラムに結合せず、精製が困難であった。そこで、新たにグルタチオン転移蛋白との融合ベクターを用いて、ドメインIVを融合蛋白として発現させたところ、グルタチオンカラムにより容易に精製デきるようになった。

The "real" bacteria of 1.DnaA protein are commonly used to copy chromosomes and control chromosomes. I, 5, DnaA protein, protein, acid, acid The combination of the ATP column contains the height of the column, the height of the storage device, the 100-terminal of the C-terminal, and the unknown configuration of the computer. The configuration of the column contains the height of the column, the III of the C-terminal, the 100% of the C-terminal, and the unknown configuration of the computer. The DnaA protein is presumed to be valid, and the DnaA protein is not known. two。 The protein of Bacillus subtilis DnaA was partially decomposed by Fine Aspergillus subtilis DnaA protein, and the partial 32kd protein was partially decomposed by Fusarium subtilis. The results showed that there was a common enzyme in the product, N-terminal amino acid column, enzyme II III, III IV level 2, and the sensitive part of the target cell. 3. Some of the decomposed products can be separated by the combination of nativeDNAcellulose and DNA, which can be used to make sure that the data is not available, and that it is necessary to make sure that the combination of DNA is necessary. The combination of protein, protein, IV, protein, protein 4. The DnaA protein of Bacillus subtilis was isolated from IV. The biochemistry was analyzed by biochemical analysis. You want to combine the protein with the protein, the protein. The fusion protein, IV, fusion protein, protein and protein.

项目成果

Fujita,M.Q.: "Structure of the dnaA and DnaA-box region in the Mycoplasma capricolum chromosome:conservation and variations in the course of evolution" Gene. 110. 17-23 (1992)

Fujita，M.Q.：“山羊支原体染色体中 dnaA 和 DnaA-box 区域的结构：进化过程中的保守性和变异”基因。