複製と転写の制御蛋白DnaAの機能構造の解析と結晶化

1.DnaA蛋白は真正細菌で普遍的に染色体の複製及び遺伝子の発現を制御する。我々は、5細菌のDnaA蛋白のアミノ酸配列を比較することにより、N-末端的60アミノ酸からなる中程度に配列が保存されているドメインI、続く、細菌毎に長さが異なり(40-100アミノ酸)、配列に保存性が認められないドメインII、的230アミノ酸からなり、ATP結合配列を含む配列が高度に保存されているドメインIII、C-末端的100アミノ酸からなり、機能未知の配列が保存されているドメインIVの4ドメインからDnaA蛋白が構成されていると推定した。2.そこで、3種のプロテアーゼを用いて精製した枯草菌DnaA蛋白の部分分解を試みたところ、40kdおよび32kdの部分分解産物が共通して得られ、そのN-末端のアミノ酸配列から、ドメインIIとIII、ドメインIIIとIVの境界の2箇所に、特異的なプロゼアーゼが感受性部位があることが明らかになった。3.部分分解産物をnativeDNAcelluloseカラムによりDNA結合能を保持している産物と失った産物を分画したところ、ドメインIVを含む産物のみが結合し、それがDNA結合に必須であることが明らかとなった。そこで、ドメインIVとマルトース結合蛋白とのハイブリット蛋白を部合精製し、ゲルシフト実験を行ったところ、DnaA-boxを含む断片にのみ結合し、確かにドメインIVのみで特異的なDNA結合能があることが証明された。4.枯草菌DnaA蛋白のドメインIVを単独に精製しその機能を生化学的に解析することを目指したが、予想に反してマルートース結合蛋白とのハイブリッド蛋白がマルトースカラムに結合せず、精製が困難であった。そこで、新たにグルタチオン転移蛋白との融合ベクターを用いて、ドメインIVを融合蛋白として発現させたところ、グルタチオンカラムにより容易に精製デきるようになった。

1.DnaA蛋白は真正細菌で普遍的に染色体の複製及び遺伝子の発現を制御する。我々は、5細菌のDnaA蛋白のアミノ酸配列を比較することにより、N-末端的60アミノ酸からなる中程度に配列が保存されているドメインI、続く、細菌毎に長さが異なり(40-100アミノ酸)、配列に保存性が認められないドメインII、的230アミノ酸からなり、ATP結合配列を含む配列が高度に保存されているドメインIII、C-末端的100アミノ酸からなり、機能未知の配列が保存されているドメインIVの4ドメインからDnaA蛋白が構成されていると推定した。2.そこで、3種のプロテアーゼを用いて精製した枯草菌DnaA蛋白の部分分解を試みたところ、40kdおよび32kdの部分分解産物が共通して得られ、そのN-末端のアミノ酸配列から、ドメインIIとIII、ドメインIIIとIVの境界の2箇所に、特異的なプロゼアーゼが感受性部位があることが明らかになった。3.部分分解産物をnativeDNAcelluloseカラムによりDNA結合能を保持している産物と失った産物を分画したところ、ドメインIVを含む産物のみが結合し、それがDNA結合に必須であることが明らかとなった。そこで、ドメインIVとマルトース結合蛋白とのハイブリット蛋白を部合精製し、ゲルシフト実験を行ったところ、DnaA-boxを含む断片にのみ結合し、確かにドメインIVのみで特異的なDNA結合能があることが証明された。4.枯草菌DnaA蛋白のドメインIVを単独に精製しその機能を生化学的に解析することを目指したが、予想に反してマルートース結合蛋白とのハイブリッド蛋白がマルトースカラムに結合せず、精製が困難であった。そこで、新たにグルタチオン転移蛋白との融合ベクターを用いて、ドメインIVを融合蛋白として発現させたところ、グルタチオンカラムにより容易に精製デきるようになった。