多複製開始点をもつゲノムの複製開始と制御の分子機構

具有多个复制起点的基因组中复制起始和控制的分子机制

• 批准号: 03261206
• 负责人: 犬塚 學
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: 福井医科大学
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1991
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1991 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-03261206/
• 关键词: DNA複製; マルティオリジン レプリコン; プラスミドR6K; DnaA蛋白; DnaA‐box配列; 部位特異的変異; 蛋白ーDNA相互作用

原核生物レプリコンは大部分、単一の複製開始点(ori)でDNA‐蛋白複合体(イニシオソ-ム)を構築し、複製を開始する。一方、真核細胞のゲノムでは多くのoriクラスタ-からスタ-トするが、その分子機構は全くわかっていない。そこで、本研究では、5.5kb内にoriα,β,γの多複製開始点をもつプラスミドR6Kをモデルレプリコンとして選び,マルティオリジンからの複製開始が如何に起こり、どのように制御されているかを明らかにしたい。本年度はまず、R6Kの3つのoriの活性化に宿主のイニシエ-タ-蛋白,DnaA,およびiterons(π蛋白の結合部位)の結合部位)の両側に存在するDnaA‐box(I), (II)がどのように機能するかを中心に解析を行ない、次の興味ある結果を得た。1.3個のoriα,β,γをクロ-ニングし、シスに作用するDNA配列を決定した。2.DnaA蛋白はin vivo,in vitroの両複製系において、3つのoriのいずれからの複製開始にも必須であった。3.DnaA‐box Sequencesのsite directed mutagenesisやdeletion mutants解析より、oriα,oriβはDnaA‐box(II)のみを要求し、oriγは両box(I),(II)が不可欠であることを明らかにし、ori機能での興味ある差異を見い出した。4.ゲルシフトアッセイで、DnaA蛋白はDnaA‐box(I)配列よりも、全てのori機能に必須のbox(II)により強い親和性を示した。今後、これらの成果を踏まえて、π蛋白やDnaA蛋白がiteronsやDnaA‐boxesに結合後、3〜2kbも離れたoriα,oriβをいかに活性化するかをπ蛋白を介してのDNA loopingや各々のoriでのイニシオソ-ムの構築などを中心に解明することにより明らかにしていきたい。

In prokaryotes, most of the DNA-protein complexes are built at the single replication start point (ori) and replication begins. The molecular structure of eukaryotes and eukaryotes is completely different. In this study, we investigated how to control the replication initiation of oriα,β,γ within 5.5kb. This year, we obtained the results of DnaA‐box(I), (II), central analysis and secondary interest analysis on the side of host protein,DnaA, and iterons(binding site of pi protein) in the activation of R6K and its 3 elements. 1. Three oriα,β,γ genes determine DNA alignment. 2. DnaA protein is in vivo,in vitro and replication system, 3. ORI and replication start must be started. 3. DnaA ‐box Sequences site directed mutagenesis deletion mutants analysis, oriα,oriβ DnaA‐box (II) 4. DnaA protein has strong affinity for DnaA-box(I) alignment and box(II) alignment essential for all ORI functions. In the future, the results of this research will be summarized as follows: After the combination of π protein and DnaA protein with iterons and DnaA-boxes, 3 ~ 2 kb DNA will be isolated from oriα and oriβ, and the activation of π protein will be mediated by DNA looping and the construction of various ori systems.

项目成果

N. Nomura: "Identification of eleven single‐stranded initiation sequences(ssi)for priming of DNA replicaion in the F,R6K,R100 and ColE2 Plasmids." Gene. 108. 15-22 (1991)

N. Nomura：“F、R6K、R100 和 ColE2 质粒基因中 DNA 复制启动的 11 个单链起始序列 (ssi) 的鉴定。”108. 15-22 (1991)

K. Anwar: "Detection of HPV DNA in neoplastic and non‐neoplastic cervical specimens from pakistan and Japan by non‐isotopic in situ hypridization." International Journal of Cancer. 47. 675-680 (1991)

K. Anwar：“通过非同位素原位杂交检测来自巴基斯坦和日本的肿瘤性和非肿瘤性宫颈标本中的 HPV DNA。”47. 675-680 (1991)。

M. Inuzuka: "Replication of a multi‐orign replicon:Requirement of DnaA protein and DnaA‐box sequences for initiation of in vivo and in vitro replication at all three origns of plasmid R6K."

M. Inuzuka：“多源复制子的复制：在质粒 R6K 的所有三个源点启动体内和体外复制所需的 DnaA 蛋白和 DnaA-box 序列。”